Hochdurchsatz-Fluoreszenzanalyse zur Untersuchung von Mikrobe-Wurm-Interaktionen

Abstract

Quelle: Ali, I., et al. Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video demonstriert einen Hochdurchsatz-Fluoresziertest, um zu bewerten, wie Darmbakterien die Stressresistenz bei Caenorhabditis elegans beeinflussen. Durch die Verfolgung der blauen Fluoreszenz aus geplatzten Darmgranulaten zeigt der Test frühere Todessignale bei Würmern, die Testbakterien ausgesetzt waren.

Protocol

1. Etikettenfreie Caenorhabditis elegans (C. elegans) Überlebensbewertung (LFASS) Hitzeschock- und oxidatives Assay-Setup (Tage 13 - 14)

1. Bewerten Sie den Entwicklungsstand der Würmer. Sobald >90 % der Würmer L4 erreicht haben, sammeln Sie die Würmer in bis zu 10 ml steriler M9-Lösung in 15 ml konischen Röhren.
2. Waschen Sie die Würmer ausgiebig (mindestens 4 Mal), indem Sie sie bei 142xg für 2 Minuten bei 4 °C drehen, das Supernatant entfernen und zwischen jedem Waschen 10 ml frisches, steriles M9 hinzufügen, um Escherichia coli OP50-Bakterien loszuwerden. Das Wurmpellet in 10 mL M9 wieder suspendieren.
3. Übertragen Sie 50 μL Wurmlösung in ein Bindungsrohr mit niedriger Oberfläche, das 950 μL M9 enthält. Nachdem Sie den Röhreninhalt vorsichtig vermischt haben, um Wurmablagerungen zu vermeiden, verwenden Sie schnell eine benetzte, niedrigbindende Pipettenspitze, um 3–4 separate 10-μL-Tropfen auf eine Glasfolie oder eine Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)-Platte zu übertragen. Zähle die Wurmzahlen unter einem Stereomikroskop mit 16-facher Vergrößerung. Zähle die Zählung von den 3-4 Tropfen und bestimme die Anzahl der Würmer pro Mikroliter in der Wurmlösung.
4. Passen Sie die Wurmkonzentration im 10-mL-Rohr an, um ~120 Würmer in 8 μL zu erreichen. Wenn die Lösung in Schritt 1.2 vorbereitet ist. ist nicht konzentriert genug, spinnen Sie die Würmer nach unten und entfernen Sie M9 entsprechend, um 120 Würmer pro 8 μL zu erreichen.
5. Übertragen Sie 8 μL Wurmlösung (~120 Würmer) in jede der Brunnen der acht zuvor vorbereiteten 96-Bohrloch-NGM-Agarose-Platten mit Verwendung einer Mehrkanalpipette oder einer Wiederholungspipette. Achten Sie darauf, Spitzen mit niedriger Bindung zu verwenden, um den Wurmverlust zu begrenzen. Es kann auch notwendig sein, die Spitzen abzuschneiden, um große erwachsene Würmer zu ermöglichen und so die mechanische Belastung der erwachsenen Würmer zu minimieren.
   ANMERKUNG: Der Test erfordert mindestens 30 lebende, gesunde Würmer, um zuverlässig zu wirken, funktioniert aber am besten mit etwa 100 Würmern pro Brunnen.
6. Inkubieren Sie die mit Wurm und Bakterien besetzten 96-Well-NGM-Agaroseplatten bei 25 °C für 36 Stunden.
7. Überprüfen Sie die Platten zwischen 12 und 24 Stunden, um sicherzustellen, dass die Würmer durchgehend vollständig bleiben. Falls eine Wiederfütterung erforderlich ist, suspendieren Sie die Bakterien in der 96-Well-Bakterien-Array-Platte, die bei 15 °C gelagert ist, und fügen Sie bis zu 10 μL der entsprechenden bakteriellen Lösung zu den 96-Well-NGM-Agarose-Platten hinzu, bei denen die Würmer vor Ablauf der 36-Stunden-Inkubationszeit gefährdet sind (ausgehungerte Würmer erzielen sehr unterschiedliche Ergebnisse, Das ist also sehr wichtig).
   ANMERKUNG: Die folgenden Schritte müssen am 15. Tag durchgeführt werden. Vor Beginn des Tests kann es notwendig sein, die Lesehöhe zu optimieren. Die optimale Messung wird 20–50 μm über dem Boden des Bohrlochs erreicht. Dies hängt vom Modell des Kennzeichenlesers ab. Einige bieten die Möglichkeit eines Z-Scans, während andere manuelle Höheneingabe erlauben. Stellen Sie die optimale Höhe auf dem Niveau ein, auf dem das höchste blaue Fluoreszenzsignal (365 nm/430 nm) detektiert wird. Einige Kennzeichenleser arbeiten möglicherweise in einer festen Höhe, die für Adherent-Zell-Assays optimiert ist, und sind möglicherweise nicht ideal für LFASS-Assays.
8. Nach 36 Stunden geben Sie 30 μL M9 in jede Mulde der 96-Bohrloch-Platte ein.
   ANMERKUNG: Für thermische Belastungstests muss der Plattenleser die erforderliche Temperatur erreicht haben, um den Test durchzuführen, und muss möglicherweise vorher eingeschaltet werden. Das aktuelle Protokoll verwendet 42 °C, um die Tötungsgeschwindigkeit zu maximieren, aber der Ansatz gilt für andere Temperaturen über 30 °C.
9. Übertragen Sie die Würmer (etwa 20 μL) auf die 384-Well-Platte gemäß den Set-Layouts und verwenden Sie Spitzen mit niedriger Retention (ziehen Sie das Ende der Spitzen ab, um große Würmer zu ermöglichen und so mechanische Belastung für erwachsene Würmer zu reduzieren).
   ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie werden für die beiden hier beschriebenen Tests (thermischer Stress und oxidativer Stress) zwei verschiedene Plattenleser-Einstellungen verwendet, sodass Proben, die für diese beiden Tests vorgesehen sind, nicht in derselben 384-Well-Platte verschichtet werden dürfen.
10. Stellen Sie sicher, dass die Kennzeichenleser richtig eingerichtet sind (Tabelle 1).
11. Füllen Sie die 384-Well-Platten mit mehr M9 auf, mit dem Ziel eines Endvolumens von 60 μL pro Well. Für den thermischen Spannungstest werden 40 μL M9 hinzugefügt, und für den durch tert-Butylhydroperoxid (t-BHP)-induzierten oxidativen Stress 34 μL M9 in 6 μl t-BHP.
    1. Beginnen Sie den Test innerhalb von 2 Minuten nach der Zugabe von t-BHP (idealerweise müssen alle Würmer gleichzeitig t-BHP ausgesetzt sein, wobei die Prüfzeit 2 Minuten dauert). Wenn dies nicht möglich ist, verwenden Sie einen Timer, um die Zeit zu schätzen, die vor Beginn des Tests für das Pipetteren von t-BHP benötigt wird, um eine spätere Anpassung der mittleren Todeszeit zu ermöglichen.
12. Schließe die Teller mit ihrem transparenten Deckel. Versiegeln Sie die Ränder der 384-Well-Platten mit Malerband (Klebeband über Platte und Deckel) und achten Sie darauf, dass das Klebeband weder über den Deckel noch unter die Platte verläuft. Schneiden Sie das Band zwischen Deckel und Platte in Abständen mit einem Skalpell, um den Luftaustausch zu ermöglichen und während des Tests die Verdunstung zu minimieren.
13. Stecken Sie das Kennzeichen in den Kennzeichenleser und starten Sie den Durchlauf. Zielen Sie, bei 365 nm anzuregen und Emission bei 435 nm alle 2 Minuten für 6-12 Stunden zu erkennen (Tabelle 1).
    ANMERKUNG: Typischerweise reichen 6 Stunden für 42 °C Hitzestress-Assays und 8 Stunden für 7 % t-BHP-oxidative Stress-Assays.

Tabelle 1: Oxidations- und Hitzestress-Assay-Einstellungen. Beispiele für Einstellungen für oxidative (A) und Wärme (B) Spannungstests auf den in dieser Studie verwendeten Fluoreszenzplattenleser.

Materials