Extraktion apoplastischer Bakterien mit einer spritzenbasierten Druckmethode

Abstract

Quelle: Rufián, J. S. et al., Einzelzellanalyse der Expression von Pseudomonas-syringae-Genen im Pflanzengewebe. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video demonstriert eine spritzenbasierte Druckmethode zur Extraktion apoplastischer Bakterien, die sich im Apoplasten, dem interzellulären Raum zwischen Pflanzenzellen, vermehren und Mikrokolonien bilden. Die Methode liefert ablagerungsfreie Bakterienproben, die für die nachgelagerte Einzelzellanalyse geeignet sind.

Protocol

Extraktion von Bakterien aus dem Apoplast

1. Vier Tage nach der Impfung schneiden Sie entweder den Luftteil der Arabidopsis-Pflanze oder das geimpfte Blatt von der Bohnenpflanze ab und legen Sie es ohne Nadel in eine 20-ml-Spritze (Abbildung 2G). Bei Bohnenblättern rollt man das Blatt auf sich selbst, wobei die abaxiale Fläche nach außen bleibt, wie in Abbildung 2F dargestellt.
2. Füge genug destilliertes Wasser hinzu, um das Gewebe zu bedecken (meist 10–15 ml).
3. Stecken Sie den Kolben ein und entfernen Sie mit der Spritze in vertikaler Position und der Spitze nach oben die überschüssige Luft und Luftblasen in der Spritze, indem Sie sanft auf den Lauf klopfen, bis die gesamte Luft in der Nähe der Spitze ist. Schiebe den Kolben aus, um die Luft herauszulassen. Sobald so wenig Luft wie möglich in der Spritze ist, decken Sie die Spitze des Spritzenrohrs mit Paraffinfilm ab.
4. Drücken Sie vorsichtig den Kolben, um einen positiven Druck zu erzeugen, bis das Gewebe dunkler wird (Abbildung 1I und Abbildung 2H). Dann zieht man den Kolben, um Unterdruck zu erzeugen (Abbildung 1J und Abbildung 2I). Wiederhole diesen Schritt 3-5 Mal.
5. Entfernen Sie den Paraffinfilm und den Kolben und sammeln Sie die Flüssigkeit mit den vom Apoplast extrahierten Bakterien auf, wie in Abbildung 2J.

Results

Abbildung 1: Bakterielle Impfung und Apoplast-Extraktion mit Arabidopsis-Pflanzen . (A) Vorbereitung des Topfes mit richtig befestigtem Metallgitter. (B) Samen mit ...

Materials