Induzierbare Expression von histidin-markiertem Ricintoxin A-Kette in E. coli

Zusammenfassung

Quelle: Becker, B., et al. Ein einfacher, fluoreszenzbasierter Reporter-Assay zur Identifizierung zellulärer Bestandteile, die für den Transport von Ricintoxin A-Kette (RTA) in Hefe benötigt werden. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert die induzierbare Expression der His-markierten Rizintoxin-A-Kette (RTA) in Escherichia coli. Er beschreibt die Schritte zur selektiven Kultivierung von Bakterien, die mit einem rekombinanten Expressionsplasmid transformiert wurden, die Induktion der His-markierten RTA-Expression und die Vorbereitung der Bakterien für weitere Analysen.

Protokoll

1. Heterologe Expression der His-markierten Rizintoxin-A-Kette (RTA) in Escherichia coli

1. Transformieren Sie Escherichia coli (E. coli)-Zellen mit dem Expressionsplasmid pET24-RTA_(His)6 oder dem leeren Vektor pET24a⁽⁺⁾ mit Standard-Elektroporationsprotokollen. Zellen, die das leere Plasmid enthalten, dienen als negative Kontrolle.
2. Nach der Auswahl positiver Klone auf kanamycinhaltigen (100 μg/mL) LB (Lysogeny Fellh) Platten inokulieren Sie Zellen, die das RTA-Expressionsplasmid oder den leeren Vektor enthalten, in 5 mL LB_Kan-Medium (LB-Medium mit 100 μg/mL Kanamycin) und inkubieren bei 37 °C und 220 U/min für 24 Stunden.
3. Ergänzen Sie 1 L LB_Kan-Medium mit 5 ml Vorkultur und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 220 U/min, bis die Zellen einen OD₆₀₀ von 0,8–1,0 (ca. 3–4 Stunden) erreicht haben. Anschließend wird die Kulturtemperatur auf 28 °C reduziert und eine 1 M Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)-Lagerlösung in H₂O hergestellt.
4. Induzieren Sie die RTA-Expression des E. coli , indem Sie IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzufügen.
5. Nach 3,5 Stunden bei 28 °C und 220 U/min werden die Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 x g und 4 °C für 10 Minuten entnommen, das Pellet zweimal mit 5 mL Bindungspuffer (500 mM NaCl, 10 mM Imidazol und 20 mM KH₂PO₄, pH = 7,4) bei 10.000 x g und 4 °C für 10 Minuten gewaschen, und das Pellet in einem 5-mL-Bindungspuffer neu suspendieren.
   ANMERKUNG: Das Protokoll kann in diesem Stadium pausiert werden, und Zellen können mehrere Tage bei 80 °C gelagert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bakterienstamm
E. coli BL21 DE3(Gold)	Agilent Technologien	230130
In diesem Protokoll verwendete Plasmide
pET24a⁽⁺⁾ (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA₍His₆₎
Reagenzien
LB-Brühemedium	Thermowissenschaftlich	10855021	Für die Plattenproduktion wurden 15 g Agar hinzugefügt
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G