Eine Affinitätschromatographietechnik zur Reinigung eines rekombinanten bakteriellen Proteins

Zusammenfassung

Quelle: Becker, B., et al. Ein einfacher, fluoreszenzbasierter Reporter-Assay zur Identifizierung zellulärer Bestandteile, die für den Transport von Ricintoxin A-Kette (RTA) in Hefe benötigt werden. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video demonstriert die Reinigung eines polyhistidin-markierten rekombinanten Proteins mittels nickelbasierter Affinitätschromatographie. Es beschreibt wichtige Schritte, darunter bakterielle Lyse durch Sonikation, Klärung und Filtration des Lysats sowie selektive Bindung und Eluation des Zielproteins mit Imidazol.

Protokoll

1. Reinigung von HIS-markierten RTA mittels Affinitätschromatographie

1. Sonikatzellen auf Eis mit folgendem Protokoll: 15 s Puls (20 Mikrometer), 30 s Pause. Wiederhole diesen Schritt fünfmal.
2. Zentrifugieren Sie Zelllysat bei 21.000 x g und 4 °C für 15 Minuten und filtern Sie den Supernatant mit einem sterilen Spritzenfiltersystem (0,2 μm Porengröße).
   ANMERKUNG: Zellpellets erfolgreich sonizierter Proben zeigen transparente Ränder.
3. Verwenden Sie ein automatisiertes Reinigungssystem mit einer 5-mL Ni²⁺-basierten Affinitätssäule, um den His-tagged RTA-Anteil aus dem steril gefilterten E. coli-Supernatant zu reinigen . Im Allgemeinen sollte man eine Elutionsgeschwindigkeit von 1 mL/min verwenden und das gesamte Reinigungssystem kühlen, um ineffiziente Toxinbindung und Verlust der Toxinaktivität zu verhindern.
   ANMERKUNG: Parameter für eine effiziente RTA-Reinigung sind in Tabelle 1 aufgeführt.
   1. Kurz gesagt: Gleiche die Affinitätsspalte mit 20 mL Bindungspuffer aus, um den Speicherpuffer zu entfernen. Tragen Sie mit einer Spritze sterilgefiltertes Supernatant auf die Affinitätssäule auf.
   2. Waschen Sie die Säule mit 25–35 ml Bindungspuffer, um die ungebundenen Proteine aus der Säule zu entfernen. Führen Sie den Waschschritt durch, bis die UV-Absorption bei 280 nm nahe am ursprünglichen UV-Wert liegt.
   3. Elutieren Sie die gebundene RTA-Fraktion in 20–35 mL Elutionspuffer (500 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM KH₂PO₄, pH = 7,2) und lassen Sie die Probe auf Eis (Abbildung 1A und Abbildung 1B).
      ANMERKUNG: Die Elution des RTA-Anteils ist durch eine Zunahme der UV-Absorption gekennzeichnet. Bitte beachten Sie, diese Fraktion ausschließlich zu sammeln, um eine Kontamination mit unspezifischen gebundenen Proteinen zu vermeiden.

Tabelle 1: Parameter, die für die säulenbasierte Affinitätsreinigung und Entsalzung verwendet werden. Liste aller relevanten Säuleneinstellungen (z. B. Durchflussrate, Konzentration des Elutionspuffers, Gleichgewichts- und Waschschrittdauer) sowie gemessener Parameter (z. B. Leitfähigkeit oder UV-Absorption).

Affinitätschromatographieparameter
Messparameter	UV (280 nm), Elutionspufferkonzentration, Leitfähigkeit
Einstellungen	Variable/Einheit	Wert
Durchflussrate	mL/min	1
Maximaler Säulendruck	Mpa	0.35
Wellenlänge	Nm	280 nm
Bindungspuffer	Pumpenposition	Ein
Elutionspuffer	Pumpenposition	B
Start-Konzentrationselutionspuffer	%	0
Systemvolumenkompensation	Ml	10
Säulen-Equilibrierung	Ml	20
Probeninjektion über Superloop/Spritze	Ml	Zelllysatvolumen
Waschstufe	Ml	20-35
Elutionsschritt	Ml	20-35
Konzentrationselutionspuffer während der Elution	%	100
Neukalibrierung der Säule mit 20 % EtOH	Ml	50
Entsalzungsparameter
Messparameter	UV (280 nm), Leitfähigkeit
Einstellungen	Variable/Einheit	Wert
Durchflussrate	mL/min	4
Maximaler Säulendruck	Mpa	0.35
Wellenlänge	Nm	280 nm
Bindungspuffer	Pumpenposition	Ein
Elutionspuffer	Pumpenposition	B
Start-Konzentrationselutionspuffer	%	0
Systemvolumenkompensation	Ml	10
Säulen-Equilibrierung	Ml	20
Probeninjektion über Superloop/Spritze	Ml	Zelllysatvolumen
Entsalzungspufferinjektion (0,8 m Sorbitol)	Ml	100
Neukalibrierung der Säule mit 20 % EtOH	Ml	50

Ergebnisse

Abbildung 1: Repräsentative Affinitätschromatographie und Entsalzungsergebnisse von E. coli-Zellen, die pET-RTA_(His)6 oder die leere Vektorkontrolle enthalten. (A) Typisches Reinigungsdi...

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