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1. Herstellung von bakterieller Nanocellulose (BNC)
Anmerkung: Alle Schritte werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
- Bereite ein Kulturmedium vor.
- Bereiten Sie 500 ml flüssiges Kulturmedium vor, indem Sie 25 g Hefeextrakt, 15 g Pepton, 125,0 g Mannitol und 500 ml hochreines Wasser kombinieren. Autoklavieren Sie diese Mischung bei 120 °C für 20 Minuten und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Bereiten Sie 100 ml halbfestes Material vor, indem Sie 15 g Agar zu 5,0 g Hefeextrakt, 3,0 g Pepton, 25,0 g Mannitol und 100 ml hochreines Wasser hinzufügen. Autoklavieren Sie diese Mischung bei 120 °C für 20 Minuten. Nach dem Autoklavieren geben Sie 5 ml der Mischung in eine 90 mm x 16 mm große Plastik-Petrischale ab. Lassen Sie die Lösung bei 4 °C gelieren und lagern Sie bei dieser Temperatur bis zur weiteren Verwendung.
- Rehydratieren Sie den Stamm von Glucoacetobacter xylinus (G. xylinus), der in gefriergetrockneten Phiolen konserviert wird, indem Sie 1 ml flüssiges Kulturmedium hinzufügen und wie in den Herstelleranweisungen auf und ab pipettieren.
- Inokulieren Sie die Petrischalen mit halbfesten Medien mit kleinen Tröpfchen bakterieller Suspension mittels einer Impfschleife. Stellen Sie sicher, dass das Inokulum die gesamte Petrischaale bedeckt, indem Sie die Schlaufe in Zickzackrichtung vom Rand zur Mitte der Schale bewegen.
- Inkubieren Sie die Petrischalen bei 26 °C 72 Stunden lang in einem Inkubator ohne CO2. Nach Abschluss der Brutzeit sind kleine weiße Kolonien sichtbar. Wenn die Kolonien nicht sofort verwendet werden, werden die Petrischalen bei 4 °C gelagert, indem Sie den Deckel mit Parafilm verschließen und die Schalen verkehrt herum platzieren. Die Kolonien können auf diese Weise bis zu 6 Monate gelagert werden.
- Übertragen Sie 2 ml des flüssigen Kulturmediums in jede Öffnung einer 24-Wellen-Gewebekulturplatte. Nehmen Sie zwei Kolonien mit einer Impfnadel aus den geimpften Petrischalen und legen Sie sie in die erste Mulde der Gewebekulturplatte. Wiederholen Sie dasselbe Verfahren für die verbleibenden 23 Brunnen.
- Inkubieren Sie die Gewebekulturplatte 7 Tage lang bei 30 °C. Dies ergibt insgesamt 24 BNC-Pellicles mit einem Durchmesser von 16 mm und einer Dicke von etwa 2–3 mm, wie in Abbildung 1 dargestellt. Anmerkung: Stören Sie die Bakterienkultur zu keinem Zeitpunkt während der Inkubationszeit, zum Beispiel indem Sie die Platten schütteln. Während der Inkubationszeit extrudiert G. xylinus Glucopyranose-Zuckermoleküle, um ein polymeres kristallines Netz in der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche zu bilden, das unter statischen Kultivierungsbedingungen die Form und Größe des Kolbens annimmt. Diese polymere Matrix, bekannt als bakterielle Nanocellulose (BNC), ist am Ende der Inkubationszeit auffällig.
- Sammeln Sie die BNC-Pellicles aus dem Wachstumsmedium und sterilisieren Sie sie in 200 ml 1%iger NaOH-Lösung für 1 Stunde bei 50 °C, um alle Spuren von G. xylinus zu entfernen. Rühren Sie diese Lösung optional bei 300 U/min mit einer Magnetstange und einer Rührplatte um. Entsorge die NaOH-Lösung und gib 200 ml frisch zubereitete, 1 % NaOH-Lösung hinzu. Wiederholen Sie denselben Vorgang noch einmal oder bis die BNC-Pellikel in Lösung ein durchscheinendes Aussehen annehmen.
- Spülen Sie die BNC-Pellicles dreimal mit Wasser ab und lagern Sie sie in hochreinem Wasser bei RT. Stellen Sie sicher, dass die BNC-Pellicles vollständig im Wasser untergetaucht sind und zu keinem Zeitpunkt trocknen dürfen.
- Autoklaven die BNC-Pelliklen bei 121 °C für 20 Minuten. Hinweis: Eine in vivo subkutane Studie an der Ratte, durchgeführt von Märtson und Mitarbeitenden, zeigte nach 60 Wochen nach der Einnistung keine Abbauanzeichen des BNC. Tatsächlich ist BNC in der Natur durch mikrobielle und pilzbedingte Enzyme abbaubar, die bei Säugetieren fehlen. Andererseits kann die biologische Abbaubarkeit des BNC das Ergebnis mechanischer, chemischer und biologischer Prozesse sein, die das Mikrofibrillennetzwerk in vivo schwächen.
