Isolierung von Endosporen aus einer Umweltprobe durch gezielte Lyse vegetativer Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Wunderlin, T., et al. Physikalische Isolierung von Endosporen aus Umweltproben durch gezielte Lyse vegetativer Zellen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert eine Methode, um Endosporen aus einer Umweltprobe zu isolieren, die sowohl vegetative Zellen als auch verschiedene Bakterien enthält. Das Verfahren umfasst Filtration, mechanische Störung und selektive chemische Behandlung, um vegetative Zellen zu schwächen und zu lysieren, während Endosporen erhalten bleiben. Der letzte Schritt isoliert die widerstandsfähigen Endosporen durch Membranfiltration.

Protokoll

1. Herstellung von Chemikalien und Ausrüstung

1. Stellen Sie 500 ml einer 1%igen Natriumhexametaphosphatlösung (SHMP) (NaPO₃)_n her und sterilisieren Sie sie durch Autoklavierung.

2. Sterilisieren Sie Nitrocellulosefilter (NC) (Porengröße 0,22 μm, Durchmesser 47 mm) durch Autoklavierung in geschlossenen Glaspetrischalen.

3. NC-Filter (Porengröße 0,22 μm, Durchmesser 25 mm) durch Autoklavierung in geschlossenen Glaspetrischalen sterilisieren.

4. Wiegen und notieren Sie das leere Gewicht steriler 50-ml-Tuben (mit Deckel drauf) (ein Tube pro Probe).

5. Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer) 1x vorbereiten: Eine Lösung aus 10 mM Tris (Tris(Hydroxymethyl)Aminomethan) und 1 mM EDTA-Puffer. Stellen Sie den pH-Wert auf 8 ein und sterilisieren Sie sie durch Autoklavierung.

6. Bereite eine Lysozymlösung (20 mg/ml) vor, indem 0,02 g Lysozym in 1 ml TE-Puffer aufgelöst wird. Idealerweise sollte man es jedes Mal frisch machen. Lagere bei 4 °C für höchstens eine Woche.

7. Eine physiologische Lösung herzustellen, indem 8 g/L Natriumchlorid (NaCl) in destilliertem Wasser gelöst wird. Sterilisieren Sie durch Autoklavierung.

2. Trennung von Biomasse vom Sediment

1. Geben Sie 3 g Sedimentprobe in vorgewogen, sterile 50-ml-Röhrchen mit ethanolgeflammten Metallschaufeln. Führen Sie dies in einem sauberen, UV-sterilisierten Biosicherheitsschrank durch, um Kontaminationen zu vermeiden.

2. 15 ml einer 1 % sterilen (autoklavierten) SHMP-Lösung mit einer sterilen graduierten Bürette zur Probe geben. Die SHMP-Lösung kann ebenfalls gefiltert werden, um Kontaminationen zu vermeiden.

3. Homogenisiere das Sediment und die SHMP-Lösung mit einem Flüssigkeitsverteiler/Homogenisator (z. B. Ultra-Turrax-Homogenisator). 70 % Ethanol sterilisieren oder den Dispersionsrotor vor der Nutzung autoklavieren. Lass die Homogenisierung 1 Minute bei 17.500 U/min laufen. Lass die Probe 2 Minuten ruhen und wiederhole die Homogenisierung 1 Minute bei derselben Rotordrehzahl.

4. Lass die Probe 10 Minuten stehen. In diesem Schritt setzen sich die schwersten Partikel (Minerale) ab. Die Zellen und alle organischen Bestandteile der Probe bleiben jedoch in Lösung. Anschließend wird die überlagernde Lösung (mit Zellbiomasse) in ein sauberes 50-ml-Rohr übertragen, wobei man darauf achtet, das Sedimentpellet nicht zu stören.

5. Dem Sedimentpellet erneut 15 ml einer 1%-sterilen (autoklavierten) SHMP-Lösung mit einer sterilen graduierten Bürette hinzufügen. Dann wiederhole ich die Schritte 2.3 und 2.4. Diese Wiederholung sorgt für die Trennung möglichst vieler Zellen und organischer Partikel vom mineralischen Anteil des Sediments. Der Supernatant dieser zweiten Trennung kann mit dem Supernatant aus der ersten Trennung verschmolzen werden.

Anmerkung: Die folgenden Schritte werden alle am Supernatant (mit Zellbiomasse) durchgeführt. Die mineralische Komponente (Sedimentpellet) kann entsorgt werden.

6. Zentrifugieren Sie die Probe bei 20 x g für 1 Minute. Dieser Schritt erhöht die g-Kraft genug, um kleine Mineralpartikel abzusetzen, während das biologische Zellmaterial noch in Lösung bleibt. Nach der Zentrifugation wird die überlagernde Lösung (mit Zellbiomasse) in ein sauberes 50-ml-Rohr übertragen. Entsorge das Mineralpellet.

7. Bestimmen Sie das Endvolumen der Lösung mit Biomasse durch Gewichtung der Probe. Die Gewichtsbestimmung verhindert, dass die Probe in einen abgestuften Zylinder übertragen werden muss, und verringert das Kontaminationsrisiko.

3. Sammlung von Biomasse auf der Filtermembran

1. Bereiten Sie eine Filtereinheit (für Membranen mit 47 mm Durchmesser) und eine Vakuumpumpe vor. Sterilisiere die Filtereinheit entweder durch Autoklavierung oder (falls Pyrex-Glas) indem du sie mit 70 % Ethanol sprühst und mit einem Bunsenbrenner entzündest. Lass es abkühlen, bevor du mit dem Protokoll fortfahrst.

2. Eine sterile NC-Membran zur Filtrationseinheit mit ethanol-geflammtem sterilisiertem Pinzettel hinzufügen.

3. Fügen Sie die Hälfte der Überlagerungsprobe (ab Schritt 2.6) auf die Membranfiltrationseinheit ein und sammeln Sie Zellen auf der Membran mit der Vakuumpumpe.

4. Wenn die Flüssigkeit vollständig durch den Filter gegangen ist, stoppen Sie die Vakuumpumpe und entfernen Sie die Membran vorsichtig mit einer ethanol-flammensterilisierten Zang. Legen Sie die Membran in eine sterile Petrischale.

1. Schneiden Sie die Membran mit einer ethanolgeflammten, sterilisierten Schere in zwei Hälften. Gib jede Hälfte der Membran in ein separates 2-ml-Rohr. Die Hälfte der Membran wird für die DNA-Extraktion und Analyse der gesamten Bakteriengemeinschaft verwendet. Die andere Hälfte des Filters wird bei -80 °C gelagert und dient als Backup.

5. Setzen Sie eine neue NC-Membran auf die Filtereinheit und sammeln Sie Biomasse aus der zweiten Hälfte des Probenvolumens (ab Schritt 2.6) mit der Vakuumpumpe.

6. Wenn die Flüssigkeit vollständig durch den Filter gegangen ist, stoppen Sie die Vakuumpumpe und entfernen Sie die Membran vorsichtig mit einer ethanolbeflammten, sterilisierten Pinzette. Setze die gesamte Membran in ein separates 2-ml-Rohr. Diese Probe wird für die Behandlung verwendet, um Endosporen von vegetativen Zellen zu trennen. Die Probe kann bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert werden.

4. Lyse der vegetativen Zellen

1. Durchführung der Behandlung, um Endosporen von vegetativen Zellen auf der zuvor auf einer NC-Membran gesammelten Biomasse zu trennen (Schritt 3.6).

1. Wenn die Membran eingefroren war, lasse sie 10 Minuten auf RT zum Auftauen. Dann legt man die Membran in eine sterile Petrischale und schneidet sie (etwa viermal) mit sterilisierter Ethanol-Schere in kleinere Stücke. Dann werden alle Membranfilterstücke in ein steriles 2-ml-Rohr gelegt.

2. Fügen Sie 900 μl 1x TE (Tris-EDTA) Puffer (siehe 1,5) in das Rohr mit der Probemembran ein und mischen Sie gründlich im Wirbel. In diesem Schritt wird die Biomasse aus der Membran in die TE-Puffer-Lösung entfernt.

3. Setzen Sie das Rohr für 10 Minuten und 80 U/min in einen Inkubator bei 65 °C. Danach entferne ich das Rohr aus dem Inkubator und lasse es 15 Minuten abkühlen.

4. Fügen Sie 100 μl frisch vorbereitetes Lysozym hinzu (siehe 1,5), um eine Endkonzentration von 2 mg/ml zu erreichen. Fügen Sie das Lysozym nicht hinzu, bevor die Probe auf 37 °C abgekühlt ist, da dies das Enzym abbauen könnte.

5. Inkubieren Sie die Probe bei 37 °C für 60 Minuten und 80 U/min, die optimalen Bedingungen für das Lysozym, vegetative Zellen zu lysieren.

6. Nach Abschluss der Lyse werden 250 μl 3 N Natriumhydroxid (NaOH) und 250 μl 6% Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung zur Probe gegeben. Durch diese Addition erreicht das Probenvolumen 1,5 ml, und es gibt eine Endkonzentration von 0,5 N NaOH sowie eine Endkonzentration von 1 % SDS.

7. Inkubieren Sie diese Mischung bei RT für 60 Minuten und 80 U/min. Das Hinzufügen der Basis und Reinigungsmittel hilft bei der endgültigen Zelllyse. Die Konzentration dieser Reinigungsmittel wurde optimiert, um die Endosporen beim Lysieren der vegetativen Zellen nicht zu schädigen.

8. Bereiten Sie eine sterile Filtrationseinheit vor, die Membranen mit 25 mm Durchmesser durch Autoklavierung hält oder (falls Pyrex-Glas) sie mit 70 % Ethanol besprüht und mit einem Bunsenbrenner entflammt. Lass es abkühlen.

9. Setzen Sie eine 0,2 μm NC-Membran (25 mm Durchmesser) mit sterilisierter Ethanol-Flamme auf die Filteranlage.

10. Die Probe aus Schritt 4.7 auf die Membran geben und die Flüssigkeit mit der Vakuumpumpe filtern. Wenn die Flüssigkeit durchgelaufen ist, schalten Sie die Vakuumpumpe aus. In diesem Schritt wird das lysierte vegetative Zellmaterial entfernt, da es nicht auf der Membran zurückbleibt. Nur Endosporen bleiben auf der Membran.

11. Fügen Sie 2 ml sterile physiologische Lösung hinzu, um Restreinigungen abzuwaschen, und filtern Sie die Flüssigkeit mit der Vakuumpumpe.

12. Wenn die Flüssigkeit vollständig gefiltert ist, schalten Sie die Vakuumpumpe aus. Lassen Sie die Membran auf der Filteranlage.

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