Erzeugung reiner Bakterienkulturen in einem flüssigen Medium

Zusammenfassung

Quelle: Brumfield, K. D. et al., Labortechniken zur Erhaltung und Unterscheidung von Biotypen von klinischen und Umweltisolaten von Vibrio cholerae . J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt das Wachstum von Bakterienkulturen in einem flüssigen Medium. Schütteln fördert die Belüftung und verteilt die Nährstoffe gleichmäßig, unterstützt exponentielles Wachstum und führt zu einer einheitlichen, metabolisch aktiven Suspension, die für nachgelagerte Anwendungen geeignet ist.

Protokoll

1. Erhaltung und Wachstum der Vibrio-Cholerae-Stämme

1. Herstellung und Verwendung von gefrorenen Bestandskulturen
   1. Pellet 1,8 mL flüssige Übernachtkultur für 2 Minuten durch Zentrifugation (≥8.600 x g) in einem sterilen 2-mL Mikrozentrifugenrohr, entfernen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das Zellpellet in 900 μL frischer Luria-Bertani (LB)-Brühe durch Pipettierung.
   2. Fügen Sie 900 μL steriles 60%iges (v/v) Glycerol zur Kultur hinzu und mischen Sie es durch Vortexen.
   3. Die Mischung wird in ein steriles 2-mL-Kryogenrohr übertragen und unbegrenzt bei -80 °C gelagert.
   4. Zur Verwendung entfernen Sie eine kleine Menge gefrorenes Material mit einer sterilen Inokulationsschleife und Streifen für einzelne Kolonien auf LB-Agarplatten. Nach der Anwendung bringen Sie gefrorene Brühe sofort wieder auf -80 °C zurück, um ein vollständiges Auftauen der Kulturen zu verhindern. Inkubieren Sie die Platten mit dem Deckel nach unten für 12 bis 16 Stunden bei 37 °C.
2. Wachstum von Übernachtkulturen im flüssigen Medium
   1. Streifen für einzelne Kolonien (gemäß Abschnitt 1.1.4) von gefrorenem Bestand auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten mit dem Deckel nach unten für 12 bis 16 Stunden bei 37 °C.
   2. Inokulieren Sie 4 ml flüssige LB-Brühe in einem sterilen 10-ml-Kulturröhrchen mit einer einzelnen Kolonie, indem Sie die Oberfläche der einzelnen Kolonie mit einem sterilen Applikatorstab berühren und die Kolonie in die flüssige Brühe übertragen.
   3. Inkubieren Sie mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 Umdrehungen pro Minute (U/min) für 12 bis 16 Stunden bei 37 °C.

Materialien