Fluoreszierend markierte Repressorprotein-vermittelte Replikationsblockade in Escherichia coli

Zusammenfassung

Quelle: Mettrick, K. A., Lawrence et al., Induzierung einer ortsspezifischen Replikationsblockade bei E. coli mittels eines fluoreszierenden Repressor-Operatorsystems. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert eine standortspezifische Replikationsgabelblockade in Escherichia coli unter Verwendung von Arabinose-induzierter Expression von gelb fluoreszierendem Protein-markiertem TetR, das chromosomale TetO-Arrays bindet.

Protokoll

1. Blockierung der Replikation mit dem Fluoreszenz-Repressor-Operatorsystem (FROS)

1. Einleitung der Replikationsblockade
   1. Verdünnen Sie eine frische Übernachtkultur eines E.-coli-Stamms mit einem TetO-Array und pKM118 auf OD₆₀₀nm = 0,01 in einem verdünnten Komplexmedium (0,1 % Trypton, 0,05 % Hefeextrakt, 0,1 % NaCl, 0,17 M KH₂PO₄, 0,72 M K₂HPO₄) mit Antibiotika für die Selektion.
      ANMERKUNG: Tetracyclin sollte nicht zur Auswahl hinzugefügt werden, da es mit diesem System nicht kompatibel ist. Das Volumen der Kultur entspricht 10 ml pro Probe. Zum Beispiel beträgt das Kulturvolumen für das experimentelle Design in Abbildung 1 60 ml.
   2. Wachsen Sie bei 30 °C mit Schütteln bis OD₆₀₀ nm = 0,05-0,1. Entnehmen Sie eine 10-ml-Probe als uninduktionierte Kontrolle und fügen Sie 0,1 % Arabinose zur restlichen Kultur hinzu, um die Produktion von TetR-YFP aus pKM1 zu induzieren. Ziehe weiterhin sowohl die nicht induzierten als auch die induzierten Kulturen an. Nach einer Stunde wird in jeder Zelle der induzierten Kultur mit Fluoreszenzmikroskopie auf ein einzelner Brennpunkt überprüft.
   3. Wenn die induzierten Zellen als blockiert bestätigt werden (mehr als 70 % der Zellen haben einen einzigen Fokus), wird der OD₆₀₀nm erfasst und eine 7,5 ml große Probe zur Analyse mit 2D-Gelen entnommen. Nehmen Sie eine äquivalente Probe aus der nicht induzierten Kontrollkultur.

Ergebnisse

Abbildung 1: Überblick über das BOS-Replikationsblock- und Release-experimentelle Verfahren. E.-coli-Stämme, die das TetO-Array tragen, werden bei 30 °C angebaut. Wenn die Zellen einen OD_{von 600}nm von über 0,05 erreichen, wi...

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