Loop-vermittelte isotherme Amplifikation zur Nachweisung bakterieller Genen

Zusammenfassung

Quelle: Domesle, K. J. et al. Schleifenvermittelte isotherme Amplifikation zur Screening von Salmonellen in tierischen Lebensmitteln und zur Bestätigung von Salmonellen durch Kulturisolation. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video demonstriert die loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-Technik zur Erkennung eines Zielbakteriengens, indem DNA bei konstanter Temperatur amplifiziert wird. Die Reaktionsmischung wird durch Zugabe eines isothermen Master-Mixes, spezifischer Primer für das Zielgen und Proben mit DNA-Vorlagen hergestellt. Die Amplifikation wird in einem LAMP-Instrument initiiert, und die Echtzeit-Fluoreszenz wird überwacht, um das Vorhandensein des Zielgens zu bestätigen.

Protokoll

HINWEIS: Eine schleifenvermittelte isotherme Amplifikationsmischung (LAMP) enthält DNA-Polymerase, Puffer, Magnesiumsulfat (MgSO₄), Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs), Primer, DNA-Vorlage und Wasser. Die ersten vier Reagenzien sind in einer isothermen Mastermischung enthalten (Materialtabelle). Grundierungen werden intern vorgemischt, um eine Grundierungmischung (10x) zu bilden. DNA-Vorlagen können aus Anreicherungsbrühen von Tierfutterproben zu Screening-Zwecken oder aus Kulturen vermuteter Salmonellen-Isolate zur Bestätigung hergestellt werden. Zusätzlich sind bei jedem LAMP-Lauf eine positive Kontrolle (DNA aus beliebigen Salmonella-Referenzstämmen, z. B. Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) und eine No-Template-Kontrolle (NTC; steriles molekulares Wasser) enthalten.

1. Herstellung von DNA-Vorlagen

1. Um DNA-Vorlagen aus tierischen Nahrungsanreicherungen herzustellen, befolgen Sie diese Schritte.
   1. Aseptisch 25 g Tierfutterprobe (z. B. Trockenfutter, Trockenfutter für Hunde, Rinderfutter, Pferdefutter, Geflügelfutter und Schweinefutter) in einen sterilen Filterbeutel (Materialtabelle) oder gleichwertig zu wiegen. Stellen Sie den Beutel während der Inkubation in einen großen Behälter oder ein Regal zur Unterstützung.
   2. Fügen Sie 225 ml steriles gepuffertes Peptonwasser (BPW) hinzu. Gut mischen durch Wirbel und kurze Handmassage. 60 ± 5 Minuten bei Zimmertemperatur stehen lassen.
   3. Gut mischen, indem man ihn schwenkt, und den pH-Wert mit einem Testpapier bestimmen. Stellen Sie den pH-Wert gegebenenfalls auf 6,8 ± 0,2 mit steriler 1 N Natriumhydroxid (NaOH) oder 1 N Salzsäure (HCl) an. Inkubieren Sie bei 35 ± 2 °C für 24 ± 2 Stunden.
   4. Mischen Sie gut, indem Sie die Tüte mit den Brühen zur tierischen Nahrungsbeschäftigung schwenken. Übertragen Sie 1 ml von der gefilterten Seite des Beutels auf ein Mikrozentrifugenrohr. Vortex kurzzeitig.
   5. Extrahieren Sie DNA mit einem Probevorbereitungsreagenz (Materialtabelle) wie folgt.
      1. Zentrifugiere bei 900 x g für 1 Minute, um große Partikel zu entfernen und Überstandsmittel in ein neues Mikrozentrifugenrohr zu übertragen.
      2. Zentrifugiere bei 16.000 x g für 2 Minuten und entsorge Supernatant.
      3. Die Kugel in 100 μL des Probenvorbereitungsreagens aufhängen und bei 100 ± 1 °C für 10 Minuten in einem trockenen Wärmeblock erhitzen.
      4. Kühlen Sie auf Zimmertemperatur ab und lagern Sie die DNA-Extrakte der Probe bei -20 °C.
2. Um DNA-Vorlagen aus vermuteten Salmonellenkulturen zu erstellen, folgen Sie diesen Schritten.
   1. Beziehen Sie vermutete Salmonellen-Isolate aus Kulturisolation in allen Lebensmitteln gemäß dem FDA BAM Kapitel 5, Salmonellen Abschnitt D: Salmonellen-Isolierung.
   2. Inokulieren Sie vermutete Salmonellenisolate auf einer nichtselektiven Agarplatte (z. B. Blutagar, Nährstoffagar und Trypticase-Sojaagar) und inkubieren Sie bei 35 ± 2 °C für 24 ± 2 Stunden.
   3. Übertragen Sie mehrere einzelne Kolonien auf 5 ml Trypticase-Sojabrühe (TSB) oder Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Brühe und inkubieren Sie bei 35 ± 2 °C für 16 ± 2 Stunden.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann optional sein, wenn die vermutete Salmonellenkultur rein ist. In diesem Fall können DNA-Vorlagen hergestellt werden, indem mehrere einzelne Kolonien in 5 ml TSB aufgehängt und 500 μL der Suspension bei 100 ± 1 °C für 10 Minuten in einem trockenen Wärmeblock erhitzt werden. Fahren Sie mit Schritt 5 weiter unten.
   4. Übertragen Sie 500 μL der Übernachtkultur in ein Mikrozentrifugenrohr und erhitzen Sie bei 100 ± 1 °C für 10 Minuten in einem trockenen Wärmeblock.
   5. Kühlen Sie auf Zimmertemperatur ab und lagern Sie isolierte DNA-Extrakte bei -20 °C.
3. Um positive Kontroll-DNA herzustellen, folgen Sie ähnlichen Schritten wie oben bei der Herstellung von DNA-Templates aus vermuteten Salmonellenkulturen mit einem zusätzlichen Verdünnungsschritt.
   1. Inokulieren Sie S. typhimurium ATCC 19585 (LT2) oder beliebige Salmonella-Referenzstämme auf einer nichtselektiven Agarplatte (z. B. Blutagar, Nährstoffagar und Trypticase-Sojaagar) und inkubieren Sie bei 35 ± 2 °C für 24 ± 2 Stunden.
   2. Mehrere einzelne Kolonien auf 5 mL TSB- oder BHI-Brühe übertragen und bei 35 ± 2 °C 16 ± 2 Stunden inkubieren, um ~10⁹ CFU/mL zu erreichen.
   3. Die Kultur über Nacht in 0,1 % Peptonwasser verdünnen, um ~10⁷ CFU/ml zu erhalten.
   4. Übertragen Sie 500 μL dieser Verdünnung in ein Mikrozentrifugenrohr und erhitzen Sie bei 100 ± 1 °C für 10 Minuten in einem trockenen Wärmeblock.
   5. Kühlen Sie auf Raumtemperatur ab und lagern Sie positive Kontroll-DNA bei -20 °C.

2. Zubereitung der Grundierungmischung (10x)

1. Beziehen Sie kommerziell synthetisierte LAMP-Primer (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF und Sal4-LB) mit Standard-Entsalzungsreinigung (Tabelle 1). Bereiten Sie Lagerlösungen jedes Primers (100 μM) vor, indem Sie den Primer mit einer angemessenen Menge sterilem, molekularhaltigem Wasser rehydratieren. Gut mischen, indem Sie 10 Sekunden vortisieren und bei -20 °C (-80 °C für Langzeitlagerung) lagern.
2. Bereite die Grundierungmischung (10x) gemäß einem Arbeitsblatt (Tabelle 2) vor. Fügen Sie geeignete Mengen Grundmateriallösungen und steriles molekulares Wasser in ein Mikrozentrifugenrohr ein. Mische alle Reagenzien gut, indem du 10 Sekunden lang vortexierst. Aliquot den 10-fachen Primer auf 500 μL pro Mikrozentrifugenröhre mischen und bei -20 °C lagern.

3. Montage einer LAMP-Reaktion

HINWEIS: Um Kreuzkontamination zu verhindern, wird dringend empfohlen, die Bereiche, die zur Herstellung der LAMP-Mastermischung verwendet werden, physisch zu trennen und DNA-Vorlagen hinzuzufügen. Abbildung 1 ist ein LAMP-Diagramm.

1. Vorbereitung und Aufbau der Strecke
   1. Reinigen Sie die Bank mit Isopropanol und einer DNA- und DNase-abbauenden Lösung (Materialtabelle). Reinigen Sie Pipetten und Röhrenstreifenhalter (Materialtabelle) mit der DNA- und DNase-abbauenden Lösung.
   2. Tauen Sie die isotherme Mastermischung, Primermischung (10x), molekulare Wasserqualität, positive Kontroll-DNA und DNA-Vorlagen bei Raumtemperatur auf.
   3. Schalte das LAMP-Instrument (Table of Materials) ein und tippe auf den Öffnungsbildschirm, um auf den Startbildschirm zuzugreifen. Folgen Sie diesen Schritten, um einen Durchlauf zu erstellen.
      HINWEIS: Ein Modell des LAMP-Instruments hat 2 Blöcke (A und B) mit jeweils 8 Proben, und ein anderes Modell hat einen einzelnen Block mit 8 Proben (Materialtabelle).
      1. Tippen Sie auf LAMP+Anneal und wählen Sie Bearbeiten, um Beispielinformationen einzugeben.
         HINWEIS: Das Standard-LAMP-Betriebsprofil besteht aus einer Verstärkung von 65 °C für 30 Minuten und einer Glühphase von 98 °C bis 80 °C mit einer Abnahme von 0,05 °C pro Sekunde.
      2. Tippen Sie auf jede Musterzeile, um den Cursor zu aktivieren und relevante Beispielinformationen einzugeben, wobei Sie das AB-Blocksymbol verwenden, um zwischen den beiden LAMP-Instrumentenblöcken zu wechseln.
      3. Tippen Sie auf das Check-Symbol , wenn alle Beispielinformationen eingegeben wurden.
         HINWEIS: Optional kann das Run-Setup (genannt "Profile", das Beispielinformationen zusammen mit dem Standard-LAMP-Run-Profil enthält) für spätere Nutzung gespeichert werden. Tippe auf das Speichern-Symbol und gib dem Profil einen eindeutigen Namen. Beim nächsten Testen dieses gleichen Sample-Sets kann ein neuer Run mit dem gespeicherten Profil gestartet werden. Tippe auf das Ordner-Symbol unten links auf dem Startbildschirm und wähle Profil, um gespeicherte Profile zu laden.
2. LAMP-Reaktionseinheit
   HINWEIS: Wenn Sie beide LAMP-Instrumentenblöcke verwenden (A und B, insgesamt 16 Samples), bereiten Sie den LAMP-Mastermix für 18 Samples vor. Wenn nur ein LAMP-Instrumentenblock verwendet wird (insgesamt 8 Samples), bereitet man den LAMP-Mastermix für 10 Samples vor. Für andere Sample-Zahlen passen Sie das Volumen entsprechend an, um den Pipettverlust auszugleichen. Beziehen Sie bei jedem LAMP-Einsatz immer eine positive Kontrolle und einen NTC ein. Es wird empfohlen, jede Probe in unabhängigen LAMP-Läufen doppelt zu testen.
   1. Bereiten Sie die LAMP-Mastermischung gemäß einem Arbeitsblatt (Tabelle 3) vor. Fügen Sie geeignete Mengen der isothermen Hauptmischung, Grundprimermischung und molekularhaltiges Wasser in ein Mikrozentrifugenrohr ein und wirbeln vorsichtig drei Sekunden lang. Zentrifugieren Sie kurz.
   2. Setzen Sie den Röhrenstreifen in den Striphalter und verteilen Sie 23 μL des LAMP-Master-Mixes auf jeden Brunnen.
   3. Vortex alle DNA-Vorlagen und kurz zentrifugieren. Fügen Sie 2 μL DNA-Vorlage in die entsprechende Mulde und schließen Sie die Abdeckung fest zu.
   4. Entferne den Röhrenstreifen vom Halter und schnippe mit dem Handgelenk, um sicherzustellen, dass sich alle Reagenzien am Boden des Röhrchens gesammelt haben.
   5. Laden Sie den Röhrenstreifen in den LAMP-Instrumentenblock und stellen Sie sicher, dass die Kappen sicher sind, bevor Sie den Deckel schließen.

4. LAMP Run

HINWEIS: Während eines LAMP-Betriebs werden Fluoreszenzwerte über den FAM-Kanal erfasst. Die Zeit-zu-Spitzen-Werte (Tmax; min) werden automatisch vom Instrument für den Zeitpunkt bestimmt, an dem das Fluoreszenzverhältnis den maximalen Wert der Verstärkungskurve erreicht. Das Tm (°C) ist die Schmelz- und Glühtemperatur des endgültig verstärkten Produkts.

1. Klicken Sie auf das Run-Symbol oben rechts auf dem Bildschirm und wählen Sie die Blöcke(n) mit dem Röhrenstreifen aus, um den LAMP-Lauf zu starten.
2. Optional kannst du während der Reaktion auf die Tabs Temperatur, Verstärkung und Anneal tippen, um dynamische Veränderungen verschiedener Parameter während des LAMP-Laufs zu sehen.
3. Sobald der Durchlauf abgeschlossen ist, tippen Sie auf die Reiter Verstärkung und Anneal, um vollständige Verstärkungs- und Glühkurven zu sehen, und tippen Sie auf den Reiter Ergebnisse, um die Ergebnisse anzuzeigen.
4. Optional können Sie zur Aufzeichnung die Laufnummer oben links auf dem Bildschirm notieren, indem Sie das Format "Instrument serial number_run number" verwenden, z. B. "GEN2-2209_0030".

Tabelle 1: LAMP-Primer zum Screening von Salmonellen in tierischen Lebensmitteln und zur Bestätigung von Salmonellen durch Kulturisolation. Die Primer basieren auf der Salmonella invA-Sequenz (GenBank-Zugangsnummer M90846).

Name des Primers	Beschreibung	Sequenz (1,60–1,90 m)	Länge (bp)
Sal4-F3	Vordere äußere Zündhütte	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
Sal4-B3	Rückwärts gerichteter äußerer Primer	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	Vorwärtsinnerer Primer	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	Rückwärts verlaufender innerer Primer	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	Vorwärts-Schleifen-Primer	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	Rückwärts-Schleifen-Primer	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

Tabelle 2: Arbeitsblatt zur Vorbereitung der LAMP-Grundierungsmischung (10x). Die Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Bestandteil	Stock Konzentration (μM)	Grundprimermischung konzentriert (μM)	Volumen (μL)
Sal4-F3 Grundierung	100	1	10
Sal4-B3 Primer	100	1	10
Sal4-FIP-Grundbuch	100	18	180
Sal4-BIP-Primer	100	18	180
Sal4-LF Primer	100	10	100
Sal4-LB Primer	100	10	100
Molekularhaltiges Wasser	N/A	N/A	420
Gesamt	N/A	N/A	1000

Tabelle 3: Arbeitsblatt zur Herstellung der LAMP-Reaktionsmischung. Die Grundierungmischung (10x) wird gemäß Tabelle 2 mit Standardlösungen der in Tabelle 1 aufgeführten Primer hergestellt.

Bestandteil	Funktionierende Konzentration.	Abschließende Reaktion.	Volumen pro Probe (μL)	Lautstärke für 18 Samples (μL)	Volumen für 10 Samples (μL)
ISO-001 isotherme Mastermischung	1,67x	1x	15	270	150
Grundierungsmischung	10x	1x	2.5	45	25
Molekularqualitätswasser	N/A	N/A	5.5	99	55
Master-Mix-Subtotal	N/A	N/A	23	414	230
DNA-Vorlage	N/A	N/A	2	N/A	N/A

Ergebnisse

Abbildung 1: Ein schematisches Diagramm des Salmonella-LAMP-Arbeitsablaufs .

Materialien