Elektroporationsbasierte Abgabe fluoreszierender Biomoleküle in Bakterienzellen

Zusammenfassung

Quelle: Aigrain, L., et al. Internalisierung und Beobachtung fluoreszierender Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen mittels Elektroporation. J. Vis. Exp. (2015)

Das Video demonstriert die Abgabe von fluoreszierenden Biomolekülen in elektrokompetente mikrobielle Zellen mittels Elektroporation. Der Prozess beginnt mit der Einführung von fluorophor-markierter DNA oder Proteinen in eine gekühlte Zellsuspension. Anschließend wird ein Hochspannungsimpuls angelegt, um temporäre Membranporen zu erzeugen, wodurch das Biomolekül in das Zytoplasma eindringen kann. Nach der Rückgewinnung werden die Zellen gewaschen und gefiltert, um nicht internalisierte oder oberflächengebundene Moleküle zu entfernen. Schließlich werden die markierten Zellen für die Fluoreszenzbildgebung montiert, um intrazelluläre Komponenten sichtbar zu machen.

Protokoll

1. Elektroporation

1. Inkubation
   1. Fügen Sie bis zu 5 μl markierte Moleküle, die in einem salzarten Puffer (< 50 mM Salz) gelagert sind, zu einem einzelnen Aliquot kompetenter Zellen (20 μl Bakterien oder 50 μl Hefe) hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis.
      ANMERKUNG: Die Konzentration fluoreszenzmarkierter Moleküle in den Standardlösungen und damit die Menge der markierten Moleküle, die vor der Elektroporation der Zelle zugeführt wurden, korrelieren direkt mit der Ladeeffizienz (Abbildung 1 und Diskussion). Da einige Proteine weniger mit niedrigen Salzbedingungen kompatibel sind, könnte die Salzkonzentration im Speicherpuffer erhöht werden, aber das Volumen der markierten Moleküle, die vor der Elektroporation den Zellen zugeführt werden, muss dann verringert werden.
   2. Übertragen Sie das Gemisch aus Zellen und markierten Biomolekülen in eine vorgekühlte Elektroporationscuvette (Abstand von 0,1 bzw. 0,2 cm für Bakterien und Hefe). Klopfen Sie vorsichtig mit der Cuvette auf die Werkbank, um eventuelle Blasen aus der Lösung zu entfernen.
   3. Setzen Sie die Cuvette in den Elektroporator und legen Sie einen Hochspannungs-Elektroimpuls auf die Lösung (0,9 bis 1,8 kV/cm, siehe Diskussion für weitere Details zur Spannungswahl). Ein solcher Impuls bildet vorübergehende Poren in den Zellmembranen, sodass markierte Biomoleküle in die Zellen diffundieren können.
   4. Überprüfen Sie, ob die auf dem Elektroporator angezeigte Zeitkonstante zwischen 4 und 6 ms liegt. Niedrigere Zeitkonstanten sind oft auf eine zu hohe Salzkonzentration und/oder das Vorhandensein von Blasen in der Cuvette zurückzuführen und führen zu sehr geringer oder gar keiner Ladung der Zellen.
2. Genesung
   1. Unmittelbar nach der Elektroporation werden 500 μl reichhaltiges Medium wie Super Optimal Broth mit Katabolit-Repression (SOC), EZ Rich Defined Medium, Hefeextrakt Pepton-Dextrose (YPD) oder ein anderes reichhaltiges Medium zu den Zellen gegeben.
   2. Inkubieren Sie die Probe bei 37 °C für Bakterien und 29 °C für Hefe für 2 bis 10 Minuten. Für Viabilitätsmessungen, bei denen der Nutzer den Prozentsatz der Zellen bewerten möchte, die nach der Elektroporation wachsen und sich teilen, wird eine längere Erholungszeit (bis zu einer Stunde) verwendet, da wir solche Verzögerungen vor der ersten Zellteilung beobachten.
3. Waschschritte
   1. Waschen Sie die Zellen, um nicht-internalisierte Biomoleküle zu entfernen, indem Sie die Zellen für 1 Minute bei 3300 x g und 4 °C drehen. Entsorgen Sie den Supernatant und suspendieren Sie die Zellen in 500 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
      ANMERKUNG: Für jede Probe bereiten Sie eine Negativkontrolle von Zellen vor, die mit derselben Menge markierter Biomoleküle inkubiert sind, aber nicht elektroporiert und genau wie die Hauptprobe gewaschen sind.
   2. Wiederhole die vorherigen Schritte dreimal.
   3. Im Fall der Proteininternalisierung sollte das Waschverfahren je nach Eigenschaften und Verhalten des markierten Proteins optimiert werden. Die folgenden Schritte sind Beispiele für mögliche Optimierungen:
      1. Führen Sie die ersten drei Waschzyklen mit PBS durch, das 100 mM NaCl und 0,005 % Triton X-100 enthält, um nicht internalisierte Proteine zu entfernen, die an der äußeren Zellmembran haften könnten.
         1. Filtern Sie die elektroporierten Zellen mit einem 0,22 μm Porendurchmesser-Filter, der in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr eingebaut ist, indem die elektroporierten Zellen in den Filter pipettiert werden. Drehen Sie sie für 3 Minuten bei 800 x g und 4 °C herunter. Entfernen Sie den Durchfluss. Gib 500 μl neues PBS über die Zellen, drehe sie erneut wie zuvor und wiederhole diese Schritte einmal.
      2. Fügen Sie während des ersten Waschzyklus eine kleine Menge Protease K (10 ng in 500 μl PBS) hinzu, um die Verdauung eines nicht internalisierten Proteins zu ermöglichen.
   4. Drehen Sie die Zellen für 1 Minute bei 3300 x g und 4 °C. Entsorgen Sie das Supernatant und suspendieren Sie die Zellen in 150 μl PBS erneut.
   5. Verteilen Sie die geladene Zelllösung auf der Agarose-Platte, indem Sie den oberen Bedeckungsschlupf entfernen und 10 μl der Zellsuspension Tropfen für Tropfen verteilen. Legen Sie einen unbenutzten, sauberen, verbrannten Deckmantel (Dicke 1,5, entspricht der Mikroskopobjektivspezifikation) oben auf das Pad und drücken Sie sehr sanft auf den Schlitten.
   6. Schützen Sie die elektroporierten Zellen vor Licht, indem Sie die Pads in einer undurchsichtigen Box lagern und dabei verschiedene Proben abbilden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Zählen der Anzahl der internalisierten Moleküle mittels Photobleaching-Analyse. (A) Einzelzell-Photobleaching-Analyse. Beispiele für Fluoreszenzintensitäts-Zeitspuren (Blau: Rohdaten; rot: passend; Einlagen: W...

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