Vorbereitung von Myxococcus-Xanthus-Proben für die Lebendzellbildgebung

Zusammenfassung

Quelle: Schumacher, D., et al. Fluoreszenz-Lebendzellbildgebung des vollständigen vegetativen Zellzyklus des langsam wachsenden sozialen Bakteriums Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert die Vorbereitung und Bildgebung von Myxococcus xanthus, einem langsam wachsenden Bodenbakterium. Die Kultur wird in einem Medium angebaut, auf einen Deckdeckel mit fluoreszierenden Mikrosphären aufgetragen und mit einem vorgewärmten Agarose-Pad überlagert, um die Hydratation und Nährstoffversorgung zu unterstützen. Dieses Setup ermöglicht eine langfristige, zeitrafferbasierte Live-Bildgebung zellulärer Prozesse während der bakteriellen Zellteilung.

Protokoll

1. Vorbereitung von Mikroskopieproben

Anmerkung: Zellen, die mikroskopisch betrachtet werden sollen, werden auf einen Mikroskopdeckzettel gelegt und dann mit einem Agarose-Pad bedeckt, das Nährstoffe enthält. Der Deckmantel wird an einen Kunststoff- oder Metallrahmen geklebt, um mechanische Unterstützung zu bieten. Zur Vorbereitung auf die Mikroskopie sollte im Voraus ein großes Pad mit 1 % Agarose/TPM/0,2 % CTT vorbereitet werden, wie in den Schritten 2.1 - 2.3 beschrieben. Bitte beachten Sie auch die Materialtabelle für die hier verwendeten Produkte.

1. Bereiten Sie 500 mL TPM-Puffer vor (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM KH,₂PO₄ , pH 7,6, 8 mM MgSO₄) und sterilisieren Sie Autoklaven oder Filter mit einem Flaschendeckelfilter.

ANMERKUNG: Der sterile Puffer kann mehrere Monate bei Zimmertemperatur gelagert werden.

2. Bereite eine 1%ige Agarosemikroskopielösung mit 0,2% CTT vor (mische 1 g Agarose mit 80 ml TPM-Puffer und 20 mL 1%-CTT-Medium). Erhitze sie in der Mikrowelle, bis die Agarose geschmolzen ist.

ANMERKUNG: Der 0,2%ige CTT reicht aus, um Zellen wachsen zu lassen und Hunger zu verhindern. Höhere CTT-Konzentrationen im Mikroskopiemedium führen zu einer hohen Hintergrundfluoreszenz.

3. Füllen Sie eine Petrischale mit geschmolzener Agarose auf eine Dicke von 0,5 cm (für eine 11,5 cm x 11,5 cm große Petrischale sind etwa 60 ml geschmolzene Agarose erforderlich) und lassen Sie sie auf Zimmertemperatur abkühlen.

ANMERKUNG: Das Agarose-Pad kann bei 4 °C in feuchter Umgebung bis zu 2 Tage gelagert werden.

1. Vorwärmen Sie das 1%ige Agarose-/TPM-/0,2%-CTT-Pad mindestens 15 Minuten vor der Anwendung bei 32 °C.

ANMERKUNG: Um die Zellen für die Mikroskopie vorzubereiten, folgen Sie den Schritten 2.4 - 2.8.

4. Setzen Sie einen sterilen Glasdeckmantel (60 mm x 22 mm, Dicke: 0,7 mm) auf einen Kunststoff- oder Metallrahmen mit einem Loch in der Mitte (Abbildung 1A); Dieser Rahmen dient als mechanische Stütze für den dünnen Deckschlupf und hilft, das Driften während der Mikroskopie zu reduzieren. Befestige den Deckdeckel mit Klebeband am Rahmen.

1. Um den Rahmen vorzubereiten, schneiden Sie einen 75 mm × 25 mm großen Rahmen aus einer 1 mm dicken Metallplatte aus und schneiden dann ein entsprechend großes Loch (20 mm × 30 mm in diesem Experiment) in der Mitte.

5. Fügen Sie 10 bis 20 μL exponentiell gewachsene M.xanthus-Zellen auf den Deckzettel hinzu.

6. Fügen fluoreszierende 0,5 μm-Mikrosphären als fiduziale Marker zu den Zellen hinzu, um die Erfassung von Zellen oder Proteinen in Zeitrafferaufnahmen zu vereinfachen.

1. Die Mikrosphären mit 1:100 im TPM-Puffer verdünnen und bis zu mehreren Monaten bei 4 °C lagern. Vor der Anwendung gründlich schütteln und 5–10 μL der verdünnten Mikrokugeln in die Zellen geben.

ANMERKUNG: Hier wurden Mikrosphären verwendet, die in allen gängigen blauen, grünen, gelben und roten fluoreszierenden Kanälen fluoreszierend sind.

7. Schneiden Sie ein kleines Pad aus, das ungefähr so groß ist wie der Deckmantel des großen, vorgewärmten 1 % Agarose/TPM/0,2 % CTT-Pads und legen Sie es auf die Zellen (Abbildung 1B). Legen Sie einen Deckdeckel auf das 1%ige Agarose/TPM/0,2% CTT-Agarose-Pad, um Verdunstung zu verhindern und die Zellen in einer feuchten Umgebung zu erhalten.

ANMERKUNG: Allein der Deckmantel verhindert mindestens 2 Stunden lang eine erhebliche Verdunstung. Für längere Zeitrafferaufnahmen sollten das 1%-Agarose/TPM/0,2%-CTT-Pad und das Coverslip-Sandwich mit Paraffinfolie versiegelt werden, um Verdunstung zu verhindern.

8. Inkubieren Sie die Mikroskopieprobe bei 32 °C für 15 bis 20 Minuten, damit die Zellen am Boden des Agarosepads haften können. Dann beginnen Sie mit den Zeitraffer-Mikroskopieaufnahmen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schaltplan des in dieser Studie verwendeten experimentellen Aufbaus. (A) Ein Metall- oder Kunststoffrahmen dient als Träger für die Probe. Ein Deckdeckel wird mit Klebeband am Metallrahmen befestigt, um die Bewe...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMI6000B mit AFC	Leica-Mikrosysteme	11888945	Automatisiertes invertiertes Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit adaptiver Fokussteuerung
Universeller Montagerahmen	Leica-Mikrosysteme	11532338	Stufenhalter für verschiedene Stichprobengrößen
HCX PL FLUOTAR 100x/1,30 ÖL PH3	Leica-Mikrosysteme	11506197	Phasenkontrastobjektiv
Orca Flash 4.0 Kamera	Hamamatsu	11532952	4,0 Megapixel sCMOS-Kamera zur Bildaufnahme
Filtersatz TXR ET, k	Leica-Mikrosysteme	11504170	Fluoreszenzfilter-Set, z.B.: 560/40 Em: 645/75
Filtersatz L5 ET, k	Leica-Mikrosysteme	11504166	Fluoreszenzfilter-Set, z.B.: 480/40 Em: 527/30
Filtersatz YFP ET, k	Leica-Mikrosysteme	11504165	Fluoreszenzfilter-Set, z.B.: 500/20 Em: 535/30
ProScan III	Früher	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	Mikroskop-Automatisierungssteuerung mit interaktivem Kontrollzentrum
EL 6000 Lichtquelle	Leica-Mikrosysteme	11504115	Externe Fluoreszenzlichtquelle
Inkubator BLX Black	Pecon	11532830	Schwarze Brutkammer um das Mikroskop herum
Tempcontrol 37-2 digital	Leica-Mikrosysteme	11521719	Automatisierte Temperaturregelung für die Inkubationskammer
Gentmycinsulfat	Carl Roth	233.4	Gentamycin
Oxytetracylin-Dihydrat	Sigma Aldrich	201-212-8	Oxytetracyclin
Kanamycinsulfat	Carl Roth	T832.3	Kanamycin
Filtropur BT25 0,2 Flaschendeckelfilter	Sarstedt	831,822,101	Flaschendeckelfilter zur Sterilisation von Puffern
Deckgläser	VWR	630-1592	Glasabdeckungsschlupf (60 x 22 mm, Dicke: 0,7 mm)
Seakem LE agarose	Lonza	50004	Agarose für Mikroskopie-Objektträger
Leica Metamorph AF	Leica-Mikrosysteme	11640901	Mikroskopsteuerungssoftware und Software zur Bildanalyse
Tetraspeck-Mikroskope, 0,5 μm	ThermoFisher	T7281	Fluoreszierende Mikrosphären
Petrischale	Greiner Bio-one	688102	120 mm x 120 mm x 17 mm quadratische Petrischale für Agarosepads
BD Bacto Casitone	Becton Dickinson	225930	Casitone
Parafilm M	VWR	291-1213	Parafilm
Tris(Hydroxymethyl)-Aminomethan	Carl Roth	AE15.2	Tris
Magnesiumsulfat-Heptahydrat	Carl Roth	P027.2	Magnesiumsulfat
Kaliumdihydrogenphosphat p.a.	Carl Roth	3904.1	Kaliumdihydrogenphosphat
1 % CTT-Medium: 1 % (w/v) BD Bacto™ Casitone, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,6, 8 mM MgSO₄			Anbaumedium für M. xanthus
TPM-Puffer: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,6, 8 mM MgSO₄			Puffer zur Vorbereitung von Mikroskopieobjekten für M.xanthus