Präzise und Hochdurchsatzanalyse des Bakterienwachstums mit einem Mikroplattenleser

Abstract

Quelle: Kurokawa, M., et al. Präzise, Hochdurchsatzanalyse des Bakterienwachstums. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert die Hochdurchsatzquantifizierung des Bakterienwachstums mit einem Mikroplattenleser. Er beschreibt die Schritte, die bei der Kulturvorbereitung, der optischen Dichtemessung und der Analyse der Wachstumsdynamik erforderlich sind.

Protocol

1. Echtzeit-Aufzeichnung des Wachstums
   1. Zeichnen Sie ein 96-Well-Platten-Piktogramm (8 × 12-Tabelle), um die Positionen der inokulierten Kulturproben auf der 96-Well-Platte anzuzeigen. Druck die Tabelle aus und nutze sie als Referenz für das Experiment.
      ANMERKUNG: Die an den Rändern der Mikroplatte liegenden Brunnen sollten aufgrund der Verdunstung nur ein leeres Medium enthalten.
   2. Setzen Sie eine sterilisierte 96-Wellen-Mikroplatte mit flachem Boden und Deckel, P-1000, 1000-μL-Pipettenspitzen, P-200- und 200-μL-Pipettenspitzen, mehrere 1,5-mL-Mikroröhren, eine 8-Mehrkanal-Pipette, ein sterilisiertes Reagenzienreservoir, Raumtemperatur-M63 und die Glycerol-Stocks von Escherichia coli auf eine saubere Bank.
   3. Fügen Sie etwa 25 mL M63 in das Reagenzienreservoir hinzu. Verwenden Sie diesen Reservoirbestand für alle folgenden Schritte.
   4. Fügen Sie den Mikroröhren 900 μL M63 hinzu, um die Durchführung serieller Verdünnungen vorzubereiten.
   5. Tauen Sie den Glycerolfond bei Zimmertemperatur auf. Gib 900 μL M63 zum aufgetauten Glycerol-Stock und Vortex hinzu. Dies führt zu einer zehnfachen Verdünnung des ursprünglichen Glycerollagers.
   6. Übertragen Sie 100 μL der 10-fachen Verdünnung auf ein anderes Mikrorohr mit 900 μL M63 und Vortex. Dies führt zu einer 100-fachen Verdünnung.
   7. Wiederholen Sie Schritt 1.6, bis die gewünschte Anzahl an Verdünnungen erreicht ist.
   8. Füllen Sie die Bohrungen am Rand der Mikroplatte mit 200 μL M63 und verwenden Sie eine 8-Kanal-Pipette (P-200).
      ANMERKUNG: Diese Brunnen können als Blank verwendet werden.
   9. Laden Sie 200 μL jeder verdünnten Probe auf, die in den Schritten 1.4 - 1.7 in die Mikroplattenbohrungen gemäß der Referenztabelle (Schritt 1.1) vorbereitet wird. Wirbel die verdünnten Proben vor dem Laden und belaste dieselbe Probe in mehreren Brunnen an verschiedenen Stellen auf der Platte.
   10. Platzieren Sie die 96-Well-Mikroplatte auf den Plattenleser.
   11. Öffne "Jetzt lesen" im "Task-Manager" und wähle das Programm aus. Klicken Sie auf "OK", um mit dem Messen zu beginnen. Speichere die Aufnahme als neue experimentelle Datei für die Datenanalyse.

Materials