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1. Chaperon-Aktivitätstest mit thermisch entfaltender Malat-Dehydrogenase (MDH)
ANMERKUNG: Der Einfluss von gereinigtem HdeB auf die Aggregation der thermisch entfaltenden schweineschen mitochondrialen Malatdehydrogenase (MDH) bei unterschiedlichen pH-Werten wurde wie unten beschrieben überwacht. Alle aufgeführten Proteinkonzentrationen beziehen sich auf die Monomerkonzentration.
- Zur Herstellung von MDH wird MDH über Nacht bei 4 °C gegen einen 4-L-Puffer-C (50 mM Kaliumphosphat, 50 mM Natriumchlorid (NaCl), pH 7,5) dialysiert und das Protein mit Zentrifugalfiltereinheiten mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 30 kDa auf etwa 100 μM konzentriert.
ANMERKUNG: Eine sorgfältige Dialyse von MDH ist erforderlich, da MDH als Ammoniumsulfatlösung abgegeben wird. - Um Aggregate zu entfernen, zentrifugieren Sie das Protein 20 Minuten bei 20.000 x g bei 4 °C. Bestimmen Sie die MDH-Konzentration durch Absorption bei 280 nm (ε280 nm = 7.950 M-1 cm-1). Bereiten Sie 50 μl Aliquots MDH vor und frieren Sie die Aliquots für die Speicherung schnell ein.
- Setzen Sie eine 1-ml-Quarz-Cuvette in ein Fluoreszenzspektrophotometer, das mit temperaturkontrollierten Probenhaltern und Rührern ausgestattet ist. Stelle λex/em auf 350 nm ein.
- Fügen Sie der Cuvette geeignete Mengen vorgewärmten (43 °C) Puffer D (150 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl) bei den gewünschten pH-Werten (hier: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 und pH 5,0) zu und stellen Sie die Temperatur im Cuvettehalter auf 43 °C ein. Das Gesamtvolumen beträgt 1.000 μl.
- Fügen Sie dem Puffer 12,5 μM HdeB (oder alternativ das gleiche Volumen des HdeB-Speicherpuffers für die Puffersteuerung) hinzu, gefolgt von der Hinzufügung von 0,5 μM MDH. Beginnen Sie mit der Überwachung der Lichtstreuung. Inkubieren Sie die Reaktion 360 Sekunden, um eine ausreichende Entfaltung des MDH zu ermöglichen.
- Erhöhen Sie den pH-Wert auf 7, indem Sie 0,16-0,34 Volumen von 2 M ungepuffertem K2HPO4 hinzufügen und die Lichtstreuung weitere 440 Sekunden aufzeichnen.
- Stellen Sie das Ausmaß der MDH-Aggregation, das in Abwesenheit des Begleiters zu einem definierten Zeitpunkt nach der Neutralisation (im Folgenden 500 Sekunden, in denen die maximale Lichtstreuung von MDH beobachtet wurde) auf 100 % ein. Normalisiere die Aktivität von HdeB auf das Lichtstreusignal von MDH in Abwesenheit von HdeB bei jedem angezeigten pH-Wert.