Bewertung der schützenden Rolle eines säureaktivierten Chaperons bei E. coli unter Säurestress

Zusammenfassung

Quelle: Dahl, J., et al. Nachweis der pH-abhängigen Aktivität von Escherichia coli Chaperone HdeB In vitro und In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert den Einsatz rekombinanter E.-coli-Kulturen , um die schützende Wirkung eines säureaktivierten Chaperons während Säurestress zu bewerten. Die Überwachung des bakteriellen Wachstums zeigt ein verbessertes Überleben in chaperon-exprimierenden Kulturen im Vergleich zu Kontrollen und unterstreicht die Rolle von Chaperonen bei der Proteinstabilisierung unter Stressbedingungen.

Protokoll

1. Auswirkungen der Überexpression von Chaperon HdeB auf das Überleben von E. coli unter Säurestress

HINWEIS: Die genomische DNA von E. coli MG1655 wurde nach dem Standardprotokoll isoliert.

1. Verstärke chaperone hdeB aus E. coli MG1655 durch PCR mit Primern hdeB-BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT und hdeB-EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC CC C.
2. Richten Sie die PCR-Reaktion in 50 μl wie folgt ein: 10 μl 5x Polymerase-Puffer, 200 μM dNTPs, 0,5 μM Primer JUD2, 0,5 μM Primer JUD5, 150 ng genomische DNA MG1655, 0,5 μl DNA-Polymerase, addiere ddH₂O auf 50 μl.
3. Durchführung der Verstärkung von hdeB wie folgt: Schritt 1: 5 Minuten bei 95 °C, 1 Zyklus; Schritt 2: 30 Sek bei 95 °C, 30 Sek bei 55 °C, 30 Sek bei 72 °C, 40 Zyklen; Schritt 3: 10 Minuten bei 72 °C.
4. Kloniert das resultierende PCR-Fragment in die EcoR-I- und BamHI-Stellendes Plasmids pBAD18 unter Verwendung von Standardmethoden für das Klonieren der Restriktionsstellen. Reinigen Sie das Plasmid mit einem Plasmid-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verifizieren Sie das resultierende Plasmid durch Sequenzierung.
5. Transformiere das Plasmid, das HdeB oder den leeren Vektorsteuerung pBAD18 ausdrückt, in Stämm BB7224 (ΔrpoH) (Genotyp: F^-, λ^-, e14^-, [araD139]_B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(Sm^R) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn10(Tc^S) suhX401 deoC1 araD⁺ rpoH::kan⁺) unter Verwendung chemisch kompetenter Zellen.
   ANMERKUNG: Dieser Stamm ist temperaturempfindlich.
6. Nach 45 Sekunden Hitzeschock bei 42 °C und vor der Beschichtung inkubieren Sie die Zellen bei 30 °C und 200 U/min. Führen Sie Einzelkolonie-Streak-Outs der positiven Klone durch und inkubieren Sie über Nacht bei 30 °C. Bereiten Sie eine Übernachtkultur in 50 ml LB_Amp vor und kultivieren Sie die Zellen bei 200 U/min und 30 °C.
7. Verdünne Übernachtkulturen 40-fach zu 25 ml LB_Amp und verdünne die Bakterien in Gegenwart von 0,5 % Arabinose (Ara) bei 30 °C und 200 U/min auf einen O.D. _{600 nm} = 1,0, um die HdeB-Proteinexpression zu induzieren.
8. Für die pH-Verschiebungsexperimente verwenden Sie LB_Amp+Ara, um die Zellen auf einen O.D._{-Wert von 600 nm} von 0,5 zu verdünnen und an die entsprechenden pH-Werte anzupassen (hier: pH 2,0, pH 3,0 und pH 4,0) durch Hinzufügen geeigneter Volumina von 5 M HCl.
9. Nach den angegebenen Zeitpunkten (pH 2, 1 Min; pH 3, 2,5 Min; pH 4, 30 Min) neutralisieren Sie die Kulturen durch Zugabe der entsprechenden Volumina von 5 M NaOH.
10. Überwachen Sie das Wachstum der neutralisierten Kulturen in flüssiger Kultur 12 Stunden lang bei 30 °C mittels Überdosismessungen.

Materialien