Thermische Lyse-basierte genomische DNA-Extraktion aus einem pathogenen Bakterium

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Gulla, S., et al. Multi-Locus-Tandem-Repeat-Analyse des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri mittels multiplexer PCR und Kapillarelektrophorese. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Protokoll extrahiert genomische DNA aus Yersinia ruckeri, indem isolierte Kolonien in ultrareines Wasser suspendiert und Wärme zur Lyseierung der Zellen anwendet. Die Zentrifugation trennt den DNA-haltigen Supernatanten von Zellresten und liefert so Vorlagen-DNA, die für PCR-basierte Genotypisierung und epidemiologische Analysen geeignet ist.

Protokoll

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1. Bakterielle Kultivierung und Gewinnung genomischer DNA

Säe Y. ruckeri-Reinkulturen auf jedem geeigneten Agar-Typ aus (die Autoren verwendeten 5 % Rinderblutagar) und brüte bei 22 °C 1–2 Tage oder 15 °C 3–4 Tage aus.
Von jeder Agarplatte wird eine einzelne repräsentative Kolonie mit Inokulationsschleife ausgewählt und in 1,5 mL Zentrifugenröhren mit 50 μL ultragereinigtem Wasser übertragen. Hängen, kurz vorversetzen und 7 Minuten auf einem Heizblock bei 100 °C inkubieren.
Zentrifugieren Sie mit 16.000 x g für 3 Minuten und verwenden Sie eine Pipette, um das Überstandsmittel vorsichtig in ein leeres 1,5-mL-Zentrifugenrohr zu übertragen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, indem Sie das Supernatant als Vorlagen-DNA verwenden oder bis zu diesem Zeitpunkt bei -20 °C lagern.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
22°C/15°C Inkubator	Wie bevorzugt.	NA
Zentrifuge(n)	Wie bevorzugt.	NA
Eppendorf Safe-Lock-Röhren, 1,5 mL	Eppendorf	30120086	Zentrifugenröhren, die bei der DNA-Extraktion verwendet werden.
Gefrierschrank	Wie bevorzugt.	NA
Heizblock	Wie bevorzugt.	NA
Milli-Q-Wasser	NA	NA	Gereinigtes Wasser, das während der PCR und Kapillarelektrophorese verwendet wird. Standardrezept; hausintern produziert.
Reine Kultur von Yersinia ruckeri	NA	NA	Zum Beispiel kryokonserviert oder frisch.
Vortexer	Wie bevorzugt.	NA

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