Nachweis von Fischpathogenen mittels Variable Number Tandem Repeat (VNTR)-Analyse

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quelle: Gulla, S., et al. Multi-Locus-Tandem-Repeat-Analyse des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri mittels multiplexer PCR und Kapillarelektrophorese. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Trennung fluoreszierend markierter variabler Tandem-Repeat-(VNTR)-Amplicons, die von einem fischpathogenen Bakterium abgeleitet sind, mithilfe kapillarer Elektrophorese zur Erstellung größenspezifischer Elektropherogrammprofile zur Bakterienidentifikation.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kapillarelektrophorese-Aufbau und Betriebsbedingungen

Nach Bestätigung von PCR-Amplikonen (Polymerase-Kettenreaktion) verdünnen Sie PCR-Produkte 1:10 (v/v) in gereinigtem Wasser. Versiegeln, mischen und kurz zentrifugieren.
Arbeiten Sie in einem Rauchschrank und bereiten Sie ein Volumen Mastermischung vor, das aus 9 μL Formamid und 0,5 μL Standardgröße pro PCR-Produkt besteht (10 % Überschussvolumen zulassen). Wirbel kurz und verteilt 9,5 μL in Bohrlöcher auf einer Platte, die für das verfügbare CE-System (Kapillarelektrophorese) geeignet ist, bevor 0,5 μL verdünntes PCR-Produkt hinzugefügt werden. Versiegeln, mischen und kurz zentrifugieren.
VORSICHT:

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Avant 3500xL Genetischer Analysator	Thermo Fisher Scientific	A30469	Verwendet für die Kapillarelektrophorese-Fragmentanalyse.
BioNumerics7-Module	Angewandte Mathematik	NA	Verwendet zur Generierung von minimalen Spannungsbäumen aus MLVA-Daten.
Zentrifuge(n)	Wie bevorzugt.	NA
Eppendorf Safe-Lock-Röhren, 1,5 mL	Eppendorf	30120086	Zentrifugenröhren, die bei der DNA-Extraktion verwendet werden.
Gefrierschrank	Wie bevorzugt.	NA
Abzugsschrank	Wie bevorzugt.	NA
GeneMapper Software 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Verwendet zum Auslesen von Elektropherogrammen aus Kapillarelektrophorese.
GeneScan 600 LIZ Farbgrößenstandard v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Größenstandard, der während der Kapillarelektrophorese verwendet wird.
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Deionisiertes Formamid, das während der Kapillarelektrophorese verwendet wird. Bereite funktionierende Aliquouts vor.
Milli-Q-Wasser	NA	NA	Gereinigtes Wasser, das während der PCR und Kapillarelektrophorese verwendet wird. Standardrezept; hausintern produziert.
Multiplex PCR Plus Kit	Qiagen	206151/206152
PCR-Wärmezyklus	Wie bevorzugt.	NA
POP-7-Polymer für 3500 Dx/3500xL Dx Genetikanalysatoren	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	Trennmatrix, die während der Kapillarelektrophorese verwendet wird.
Reine Kultur Yersinia ruckeri	NA	NA	Zum Beispiel kryokonserviert oder frisch.
RNase-freies Wasser	Qiagen	NA	In: Multiplex PCR Plus Kit
Tris-borate-EDTA (TBE)-Puffer	NA	NA	Standardrezept; hausintern produziert.
Trypsin-Sojaagar/Rinder-Blutagar	NA	NA	Standardrezept; hausintern produziert.
Vortexer	Wie bevorzugt.	NA

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