Nachweis von Fischpathogenen mittels Variable Number Tandem Repeat (VNTR)-Analyse

Zusammenfassung

Quelle: Gulla, S., et al. Multi-Locus-Tandem-Repeat-Analyse des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri mittels multiplexer PCR und Kapillarelektrophorese. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Trennung fluoreszierend markierter variabler Tandem-Repeat-(VNTR)-Amplicons, die von einem fischpathogenen Bakterium abgeleitet sind, mithilfe kapillarer Elektrophorese zur Erstellung größenspezifischer Elektropherogrammprofile zur Bakterienidentifikation.

Protokoll

1. Kapillarelektrophorese-Aufbau und Betriebsbedingungen

1. Nach Bestätigung von PCR-Amplikonen (Polymerase-Kettenreaktion) verdünnen Sie PCR-Produkte 1:10 (v/v) in gereinigtem Wasser. Versiegeln, mischen und kurz zentrifugieren.
2. Arbeiten Sie in einem Rauchschrank und bereiten Sie ein Volumen Mastermischung vor, das aus 9 μL Formamid und 0,5 μL Standardgröße pro PCR-Produkt besteht (10 % Überschussvolumen zulassen). Wirbel kurz und verteilt 9,5 μL in Bohrlöcher auf einer Platte, die für das verfügbare CE-System (Kapillarelektrophorese) geeignet ist, bevor 0,5 μL verdünntes PCR-Produkt hinzugefügt werden. Versiegeln, mischen und kurz zentrifugieren.
   VORSICHT: Vorsichtig damit umgehen. Das Mischen von Formamid mit Wasser erzeugt Ameisensäure, die giftig ist.
3. Mit einem PCR-Wärmezyklus denaturieren Sie die Proben bei 95 °C für 3 Minuten, bevor sie unbegrenzt auf 4 °C abkühlen. Zentrifugieren Sie kurz und legen Sie die Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers auf ein kalibriertes CE-System.
4. Führen Sie eine Fragmentanalyse CE mit Reagenzien durch, die für das bevorzugte Gerät und folgende Einstellungen geeignet sind: 60 °C; 5-S-Injektionen mit 1,6 kV (32 V pro cm); 32 Minuten Betriebszeit bei 15 kV (300 V pro cm). Die CE-Fragmentanalyse von 24 Bohrlöchern auf einer 24-Kapillar (50 cm) dauert typischerweise etwa 50 Minuten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Avant 3500xL Genetischer Analysator	Thermo Fisher Scientific	A30469	Verwendet für die Kapillarelektrophorese-Fragmentanalyse.
BioNumerics7-Module	Angewandte Mathematik	NA	Verwendet zur Generierung von minimalen Spannungsbäumen aus MLVA-Daten.
Zentrifuge(n)	Wie bevorzugt.	NA
Eppendorf Safe-Lock-Röhren, 1,5 mL	Eppendorf	30120086	Zentrifugenröhren, die bei der DNA-Extraktion verwendet werden.
Gefrierschrank	Wie bevorzugt.	NA
Abzugsschrank	Wie bevorzugt.	NA
GeneMapper Software 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Verwendet zum Auslesen von Elektropherogrammen aus Kapillarelektrophorese.
GeneScan 600 LIZ Farbgrößenstandard v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Größenstandard, der während der Kapillarelektrophorese verwendet wird.
Hi-Di Formamide	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Deionisiertes Formamid, das während der Kapillarelektrophorese verwendet wird. Bereite funktionierende Aliquouts vor.
Milli-Q-Wasser	NA	NA	Gereinigtes Wasser, das während der PCR und Kapillarelektrophorese verwendet wird. Standardrezept; hausintern produziert.
Multiplex PCR Plus Kit	Qiagen	206151/206152
PCR-Wärmezyklus	Wie bevorzugt.	NA
POP-7-Polymer für 3500 Dx/3500xL Dx Genetikanalysatoren	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	Trennmatrix, die während der Kapillarelektrophorese verwendet wird.
Reine Kultur Yersinia ruckeri	NA	NA	Zum Beispiel kryokonserviert oder frisch.
RNase-freies Wasser	Qiagen	NA	In: Multiplex PCR Plus Kit
Tris-borate-EDTA (TBE)-Puffer	NA	NA	Standardrezept; hausintern produziert.
Trypsin-Sojaagar/Rinder-Blutagar	NA	NA	Standardrezept; hausintern produziert.
Vortexer	Wie bevorzugt.	NA