Eine synthetische orale Bakteriengemeinschaft simulierten Verdauungsphasen aussetzen

Zusammenfassung

Quelle: Arroyo, M. C., et al. Bewertung der Lebensfähigkeit eines synthetischen bakteriellen Konsortiums an der in-vitro-Darm-Wirt-Mikroben-Schnittstelle. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert die Viabilitätsbewertung einer synthetischen oralen mikrobiellen Gemeinschaft während simulierter oraler, magischer und intestinaler Verdauung. Das bakterielle Überleben wird nach jeder Phase quantifiziert und zeigt einen fortschreitenden Rückgang aufgrund von Verdauungsstress.

Protokoll

1. Bakterielles Überleben nach in-vitro gastrointestinalen Transitzuständen

ANMERKUNG: Bereiten Sie simulierte Verdauungsflüssigkeiten mit den unten beschriebenen Modifikationen vor. Bereiten Sie alle Verdünnungen mit ultrareinem Wasser vor. Filtersterilisieren Sie alle Lösungen durch einen 0,22-μm-Filter und führen Sie das Verdauungsverfahren unter sterilen Bedingungen durch.

1. Orale Verdauung:
   1. Geben Sie 3 ml der Bakteriengemeinschaft in ein 50 ml steriles Rohr, mischen Sie es mit 3 ml simulierter Speichelflüssigkeit (SSF), die in Millimol pro Liter (mmol L⁻¹): Kaliumchlorid (KCl), 15,1 enthält; Monokaliumphosphat (KH₂PO₄), 3,7; Natriumbicarbonat (NaHCO₃), 6,8; Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl₂·6H₂O), 0,5, Ammoniumcarbonat [(NH₄)₂CO₃], 0,06; Salzsäure (HCl), 1,1; Calciumchloriddihydrat (CaCl₂·2H₂O), 0,75. Fügen Sie 75 U/mL α-Amylase aus menschlichem Speichel Typ IX-A und 2 g/L Mucin aus dem Schweinemagen (Typ II) zum SSF hinzu.
   2. Die Mischung 2 Minuten bei 37 °C und 100 U/min inkubieren. Nehmen Sie eine 2-mL-Probe zur DNA-Extraktion und zur Quantifizierung der Flusszytometrie (S1).

2. Magenverdauung:

1. Fügen Sie 4 ml simulierte Magenflüssigkeit (SGF) hinzu, die (in mmol L-1): KCl, 6,9; KH₂PO₄, 0,9; NaHCO₃, 25; Natriumchlorid (NaCl), 47,2; MgCl₂·6H₂O, 0,1, (NH₄)₂CO₃, 0,5; HCl, 15,6; CaCl₂·2H₂O, 0,075. Zusätzlich enthielt das SGF 2 g/L Mucin aus dem Schweinemagen (Typ II).
2. Messen Sie den pH-Wert und stellen Sie den pH-Wert mit 1 Molar (1 M) HCl ein, falls nötig. Inkubieren Sie bei 37 °C und 100 U/min. Nehmen Sie eine 2-mL-Probe (S2).

3. Verdauung des Dünndarms:

1. Fügen Sie 4 ml simulierte Darmflüssigkeit (SIF) hinzu, die (in mmol L-1): KCl, 6,8; KH₂PO₄, 0,8; NaHCO₃, 85; NaCl, 38,4; MgCl₂·6H₂O, 0,33; HCl, 8,4; CaCl₂·2H₂O, 0,3, zum Verdauungsröhrchen.
2. Passen Sie bei Bedarf auf pH 7 mit 1 M Natriumhydroxid (NaOH) ein. Inkubieren Sie bei 37 °C und 100 U/min. Nehmen Sie eine 2-mL-Probe (S3).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mucin aus dem Schweinemagen Typ II	Sigma-Aldrich	M2378
PBS	Gibco	14190250
Millipore Milli-Q akademisches, ultrareines Wassersystem	Millipore, Merck KGaA	-
InnOva 4080 Inkubator-Schüttler	New Brunswick Scientific	8261-30-1007
Nukleasefreies Wasser	Serva-Elektrophorese	28539010
BD Accuri C6 Durchflusszytometer	BD Biosciences	653118
InnuPREP PCRpure Kit	Analytik Jena	845-KS-5010250	PCR-Reinigungskit