Gewinnung von genomischer DNA aus Pflanzenblattgewebe, das mit pathogenen Bakterien infiziert ist

Zusammenfassung

Quelle: Gulla, S., et al. Multi-Locus-Tandem-Repeat-Analyse des fischpathogenen Bakteriums Yersinia ruckeri mittels multiplexer PCR und Kapillarelektrophorese. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Protokoll extrahiert genomische DNA aus Yersinia ruckeri, indem isolierte Kolonien in ultrareines Wasser suspendiert und Wärme zur Lyseierung der Zellen anwendet. Die Zentrifugation trennt den DNA-haltigen Supernatanten von Zellresten und liefert so Vorlagen-DNA, die für PCR-basierte Genotypisierung und epidemiologische Analysen geeignet ist.

Protokoll

1. Bakterielle Kultivierung und Gewinnung genomischer DNA

1. Säe Y. ruckeri-Reinkulturen auf jedem geeigneten Agar-Typ aus (die Autoren verwendeten 5 % Rinderblutagar) und brüte bei 22 °C 1–2 Tage oder 15 °C 3–4 Tage aus.
2. Von jeder Agarplatte wird eine einzelne repräsentative Kolonie mit Inokulationsschleife ausgewählt und in 1,5 mL Zentrifugenröhren mit 50 μL ultragereinigtem Wasser übertragen. Hängen, kurz vorversetzen und 7 Minuten auf einem Heizblock bei 100 °C inkubieren.
3. Zentrifugieren Sie mit 16.000 x g für 3 Minuten und verwenden Sie eine Pipette, um das Überstandsmittel vorsichtig in ein leeres 1,5-mL-Zentrifugenrohr zu übertragen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, indem Sie das Supernatant als Vorlagen-DNA verwenden oder bis zu diesem Zeitpunkt bei -20 °C lagern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Quelle der Nuklei-Lyse, RNase, Proteinausfällung und DNA-Rehydrationslösungen
Flüssigstickstoff	Luftprodukte	N/A
Mastercycler Pro mit Bedienfeld	Eppendorf	6321000019
1250 W Mikrowelle	Panasonic	N/A
5424 Tischzentrifuge	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 digitales Wasserbad	Fisher Scientific	15-462-15Q
Metallpfannenwender	Sigma-Aldrich	Z283274
Mörser und Stößel	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mixer	Corning	6775
2-Propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Sterile 10-μL-Spitzen	TipOne	1161-3730
Sterile 200-μL-Spitzen	TipOne	1163-1730
Sterile 1250-μL-Spitzen	TipOne	1161-1750
Pipettor-Kit mit variablem Volumen	VWR	75788-460
Ethidiumbromid	Sigma-Aldrich	E1510
Agarose	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Essigsäure	Fisher Chemical	A38-212
Tris-Basis	Sigma-Aldrich	10708976001
μcuvette	Eppendorf	6138000018
Biospektrometer-Grundlegend	Eppendorf	6135000009