Soft Agar Overlay Assay zur Erkennung bakteriiozinvermittelter Tötung bei Pseudomonas syringae

Zusammenfassung

Quelle: Hockett, K. L. und Baltrus, D. A. Einsatz der Soft-Agar-Überlagerungstechnik zur Suche nach bakteriell produzierten inhibitorischen Verbindungen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Erkennung von bakteriiocinvermitteltem Tötung, indem Supernatant aus einem antibiotikainduzierten Spenderstamm auf eine weiche Agarschicht mit einem Teststamm gespott wird. Freie Zonen, die nach der Inkubation entstehen, deuten auf bakterielle Hemmung hin.

Protokoll

1. Vorbereitung von Überlagerungen und Prüfung von Supernatanten für Aktivität

1. Impfen Sie eine einzelne Kolonie eines P. syringae-Stamms , der auf Empfindlichkeit getestet wird, in 3 ml KB (King's medium B), und bebrüten Sie sie über Nacht mit Schütteln bei Raumtemperatur.
2. Am nächsten Morgen verdünne ich die Kultur um 1/100 in frische KB. 3-4 Stunden mit Schütteln bei Zimmertemperatur inkubieren.
3. Bereiten Sie sterilisiertes Wasseragar vor, indem Sie eine Suspension von 0,35–0,7 % (W/V) agar in ultrareines Wasser autoklavieren.
   ANMERKUNG: Ein Vorrat von Weichwasseragar kann in der Mikrowelle geschmolzen und wiederholt wiederverwendet werden; Für jedes Experiment muss nicht eine neue Überlagerung vorbereitet werden. Wenn Wasseragar wiederverwendet wird, ist es entscheidend, sicherzustellen, dass es nach dem Mikrowellenaufbereiten vollständig geschmolzen ist. Wenn nicht, bekommt das Overlay beim Verfestigen eine körnige Textur, was die Interpretation erschwert.
4. Vor der Anwendung wird der flüssige, weiche Agar in einem 60 °C Wasserbad aufbewahrt. Mit einer sterilen serologischen Pipette wird 3 ml Weichagar in ein steriles Kulturrohr übertragen. Bringen Sie das Kulturrohr zurück ins Wasserbad, um den geschmolzenen Zustand aufrechtzuerhalten.
5. Um die Schicht zu gießen, lassen Sie zuerst den geschmolzenen Agar abkühlen (er sollte sich warm anfühlen, aber nicht heiß beim Berühren), aber lassen Sie ihn nicht fest werden.
6. In einer sterilen Haube inokulieren Sie 100 μl der Test-Stammkultur in den weichen Agar und Wirbel, um zu mischen. Drehen Sie die Kultur 10-15 Sekunden von Hand und gießen Sie dann auf einen unteren Agar (KB Agar). Kippe die Platte in alle Richtungen, damit der weiche Agar den unteren Agar gleichmäßig bedeckt.
   ANMERKUNG: Der untere Agar kann jedes erstarrte (1,5 % Agar) Medium sein, auf dem der Teststamm kräftig wächst. Für eine Standard-Petrischale mit 100 mm Durchmesser verwenden Sie ~20 ml geschmolzenes Medium. Der untere Agar kann mehrere Wochen im Voraus vorbereitet werden (sofern er bei 4 °C ohne Trocknung gehalten wird) oder am selben Tag vorbereitet werden.
7. Decken Sie den Teller ab und lassen Sie ihn 20-30 Minuten fest werden. Achte darauf, die Platte nicht zu stören, während sie fest wird.
8. Sobald es verfestigt ist, legen Sie 2–5 μl Supernatant auf die Überlagerung. Lassen Sie die Platten über Nacht bei Zimmertemperatur inkubieren. Beobachten und notieren Sie die Ergebnisse am nächsten Morgen.
   ANMERKUNG: Es kann hilfreich sein, das Überwassermittel zu erkennen und bei einer seriellen Verdünnung des Überstandsmittels zu erkennen. Dies ermöglicht es Forschern, zwischen Bakteriophagen und Bacteriocin-Clearing-Aktivitäten zu unterscheiden. In diesem Fall wird empfohlen, 1:5- oder 1:10-Verdünnungen durchzuführen.

Materialien