Isolierung stressadaptierter Bakterien durch Einzelkolonie-Selektion

Zusammenfassung

Quelle: Jeong, H., et al. Verfahren zur adaptiven Laborevolution von Mikroorganismen unter Verwendung einer Chemostat. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video demonstriert die selektive Isolierung und das Wachstum von stressadaptierten Bakterien aus einer Kultur, die langanhaltenden Stressbedingungen ausgesetzt ist. Die Kultur wird auf stressorhaltigem Agar beschichtet, und eine einzelne Kolonie wird ausgewählt, um ein flüssiges Medium mit dem Stressor zu inokulieren. Die Absorption wird in regelmäßigen Abständen gemessen, um das Wachstum zu überwachen und die erfolgreiche Isolierung der stressangepassten Bakterien zu bestätigen.

Protokoll

1. Ausrüstungsvorbereitung

1. Besorge dir ein Chemostat-Glas (150–250 ml) oder eine Erlenmeyer-Flasche (250 ml) mit einem Einlass- und einem Auslassanschluss. Verbinden Sie die Ports mit Siliziumrohren, sodass Durchflussraten von 10–100 ml/h möglich sind. Optional können Sie einen Luftauslass, einen Luftaustritt sowie temperaturkontrollierte Wasserein- und Auslasskanäle verwenden.
2. Beschaffen Sie ein Gerät, das für das Chemostatglas geeignet ist und Rührung und Temperaturregelung ermöglicht (oder verwenden Sie einen rotierenden Schüttelinkubator).
3. Besorge zwei Peristaltikpumpen, um frisches Medium zu liefern und die Kultur zu sammeln.
4. Besorge dir ein Reservoirglas (10–20 L) mit einem mittleren Auslauf und einem Lufteinlass.
5. Verwenden Sie Siliziumrohre, die für die Verdünnungsrate geeignet sind (d. h. ID 0,8 mm, Durchflussbereich 0,06–36 ml/min; L/S 13 Schläuche).

2. Mittelpräparation und Sterilisation

1. Anfängliches Medium
   1. Lösen Sie 0,3 g Glukose, 0,08 g Ammoniumchlorid (NH₄Cl), 0,05 g Natriumchlorid (NaCl), 0,75 g Dinatriumwasserstoffphosphatdihydrat (Na₂HPO₄·2H₂O) und 0,3 g Dinatriumwasserstoffphosphatdihydrat (KH₂PO₄) in 90 ml destilliertem Wasser (D.W.) in einem Chemostatglas.
   2. Verschließen Sie das Chemostatglas zusammen mit dem Schlauch mit Klemmen. Dichte den Luftauslass nicht ab.
   3. Sterilisiere das Chemostatglas in einem Autoklaven bei 121 °C für 15 Minuten. Nach der Sterilisation wird das Chemostatglas bei Zimmertemperatur aufbewahrt.
   4. Lösen Sie 0,02 g Magnesiumsulfatheptahydrat (MgSO_{4,7H 2}O), 0,01 g Calciumchlorid (CaCl₂) und 0,1 mg Thiamin in 10 mL D.W. (Lösung A).
   5. Filterlösung A mit einer Spritze und einem vorsterilisierten Spritzenfilter (ein 0,45 μm Porenfilter).
   6. Gib die Lösung A-Filtrat in das Chemostatglas ein.
2. Spannungsmedium
   1. Lösen Sie 30 g Glukose, 8 g NH₄Cl, 5 g NaCl, 75 g Na₂HPO_{4,2H 2}O, 30 g KH₂PO₄ und 300 g Dinatriumsuccinathexahydrat (Na₂·Succinat·6H₂O; der in diesem Experiment verwendete Stressor) in 9,9 l D.W. in einem Reservoirglas.
   2. Versiegeln Sie das Reservoirglas zusammen mit dem Schlauch mit Klemmen. Dichte den Luftauslass nicht ab.
   3. Sterilisieren Sie das Reservoirglas in einem Autoklaven bei 121 °C für 15 Minuten. Nach der Sterilisation lagern Sie das Glas bei Zimmertemperatur.
   4. Lösen Sie 2 g MgSO 4,7H ₂O, 1 g CaCl₂ und 10 mg Thiamin in 100 ml D.W. (Lösung A) auf.
   5. Filterlösung A mit einer Spritze und einem vorsterilisierten Spritzenfilter (ein 0,45 μm Porenfilter).
   6. Gib die Lösung A-Filtrat in das Reservoirglas.
   7. Schließen Sie das sterilisierte Siliziumrohr aseptisch an das Reservoirglas an und schließen Sie die peristaltischen Pumpen an.
3. Hochspannungsmedium
   1. Bereite das Medium wie in Abschnitt 2.2 vor, jedoch mit einer höheren Konzentration des Stressors (d. h. 3–5 g/L höher in der Succinat-Adaptation).
      Hinweis: Dieses Protokoll dient der Anpassung an eine Spannung, die über das Medium übertragen werden kann. Im Fall physikalischer Belastungen wie Temperatur, Bewegung oder Beleuchtung sollte die Kultivierung entsprechend gestaltet werden.

3. Anfängliche Kultivierung

1. Inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von Wildtyp-Escherichia coli (E. coli) in ein 15-ml-Reagenzglas mit 4 ml Anfangsmedium.
2. Inkubieren Sie das Reagenzglas 12 Stunden lang in einem schüttelnden Inkubator bei 37 °C und 220 U/min.
3. Aseptisch 1 ml Vorkultur in das Chemostatglas übertragen.
4. Inkubieren Sie das Chemostat-Glas, um eine Belüftung (Luft 50 ml/min) und Rühren (200 U/min) bei 37 °C für 6 Stunden zu ermöglichen.

4. Stressanpassung

1. Verbinden Sie aseptisch das Ende des Siliziumrohrs von den Pumpen mit dem Chemostat-Glas.
2. Starte die Auslasspumpe (10 ml/Stunde oder mehr) und entnahme Kultur. Hinweis: Die Kultur sollte sich in der exponentiellen Phase befinden, typischerweise 4–8 Stunden nach der ersten Kultivierung.
3. Überprüfen Sie die optische Dichte (600 nm) der Kultur aus dem Auslassrohr.
4. Starten Sie die Einlasspumpe (10 ml/stunde, entsprechend einer Verdünnungsrate von 0,1 Stunden).
5. Überprüfen Sie die optische Dichte der Kultur bei 600 nm vom Auslassrohr alle 24 Stunden.
6. Betreiben Sie den Chemostat 96 Stunden (9,6-fache Umsatzdosis) oder länger. Wenn die optische Dichte stabil ist, wird das Reservoir mit dem Hochspannungsmedium ausgetauscht. Wenn die optische Dichte unter 0,2 liegt, stoppen Sie die Zufuhrpumpe für 6 Stunden. Starte die Einlasspumpe neu und prüfe, ob die optische Dichte über 0,2 liegt.
7. Erhöhen Sie allmählich die Konzentration des Stressors, indem Sie auf ein Reservoir mit einer höheren Spannungskonzentration umsteigen.
8. Nehmen Sie Proben der angepassten Kultur, wann immer sie einen Meilenstein erreicht (z. B. einen Stamm, der an 100 g/L Succinatstress angepasst ist), und lagern sie für weitere genomische Analysen.
9. Zur Probenlagerung wird die Kulturprobe (0,5 ml) mit einer sterilisierten 80%igen Glycerollösung (0,5 ml) gemischt und bei -80 °C gelagert. Hinweis: Wenn der Mikroorganismus während des ALE-Prozesses die Fähigkeit erlangt, den Stressor abzubauen, entspricht die Konzentration des Stressors im Gärungsglas nicht der im Frischreservoir.

5. Einzelkolonie-Isolation des stressangepassten Stamms

1. Bereiten Sie Agarplattenmedium (1,6 % Agar) vor, das denselben Stressor und dieselbe Mediumkonzentration enthält.
2. Nehmen Sie die Austrittskultur (0,1 ml) aus dem Chemostat ab und inkubieren Sie bei 37 °C für 16 Stunden.
3. Nehmen Sie einzelne Kolonien mit einem sterilen Zahnstocher von der Platte und inokulieren Sie sie in 15-ml-Reagenzgläsern mit demselben Stressor und in derselben mittleren Konzentration wie in der Chemostat, und inkubieren Sie 6 Stunden lang.
4. Geben Sie 1 ml Kulturbrühe in eine 250 ml Erlenmeyer-Flasche mit 50 ml Medium. Ernte alle 1 Stunde 0,5 ml der Kulturbrühe und messe den Überdosis bei 600 nm. Vergleichen Sie die Wachstumsrate des angepassten Stamms mit der des Wildtyp-Stamms angesichts des Stressfaktors.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mini-Chemostat-Fermentor	Biotron Inc.	-	Hergestellt nach Sonderauftrag
Siliziumrohr	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	Die Rohrgröße kann je nach Verdünnungsrate und Größe des Gärbehälters variiert werden.
Reservoir-Glas	Bellco	Medienaufbewahrungsflasche	20 L
Chemikalien	Sigma-Aldrich	-	Reagenzqualität
Traubenzucker	Sigma-Aldrich	G5767	ACS-Reagenz
NH₄Cl	Sigma-Aldrich	A9434	für Molekularbiologie, geeignet für Zellkultur, ≥99,5 %
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	ACS-Reagenz, ≥99 %.
Na₂HPO₄·2H₂O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	795488	ACS-Reagenz, ≥99 %.
MgSO₄·7H₂O	Sigma-Aldrich	230391	ACS-Reagenz, ≥98 %
CaCl₂	Sigma-Aldrich	793639	ACS-Reagenz, ≥96 %.
Thiamin·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	Reagenzqualität, ≥99 %
Na₂succinate·6H₂O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99 %