1. Wasser- und Korallensammlung und -lagerung zur mikrobiellen Isolierung
ANMERKUNG: Es ist wichtig, die Koordinaten und Temperatur der Probenahmestellen zu erfassen. Wenn möglich, können Metadaten wie Salzgehalt, pH-Wert, Tiefe und Lichtintensität ebenfalls helfen, fein abgestimmte Kultivierungsansätze und zukünftige Dateninterpretationen zu finden. Für zuverlässige Ergebnisse werden die Proben so lange wie möglich gespeichert. Das Wasser-/Korallenmikrobiom kann sich erheblich verändern, wenn die Proben nicht bei der richtigen Temperatur aufbewahrt und/oder lange gelagert werden. Wird der Isolationsschritt nicht sofort nach der Entnahme durchgeführt, ist es entscheidend, die Proben bis zur Verarbeitung bei 4 °C zu halten. Je länger die Proben gelagert werden, selbst bei 4 °C, desto mehr verändert sich die mikrobielle Gemeinschaft.
- Probe und lagere Meerwasser.
- Sammeln Sie 500 ml Wasserproben in mindestens dreifachem Exemplar von jedem Zielabnehmer. Am besten verwenden Sie sterile Flaschen mit Schraubverschlüssen.
- Wenn du das Wasser sofort nach der Abnahme aufbereitest, halte die Flaschen für kurze Zeit auf RT. Wenn die Probenverarbeitung später stattfindet, halten Sie die Flaschen bei 4 °C.
- Probe und lagere die Koralle.
- Verwenden Sie eine sterile Zange, um Korallenfragmente von derselben Probenahme wie die Wasserproben zu schneiden. Um eine Kontamination zu vermeiden, sollten Korallen nur mit sterilen Handschuhen berührt werden.
- Spülen Sie das beprobte Korallenfragment mit 20 ml steriler Kochsalzlösung (3 % NaCl im destillierten Wasser) oder künstlichem Meerwasser, um die locker angehefteten freilebenden Bakterien des Meerwassers zu entfernen.
- Mit einer Zange wird jedes Korallenfragment in einen sterilen 250−500 mL Behälter mit einem Schraubverschluss mit steriler Kochsalzlösung gegeben.
- Im Labor werden mit sterilen Pinzetten und Zangen 5 g Korallenfragmente mit sterilen 100 mm x 20 mm Petrischöpfen auf einer Waage gewichtet.
- Geben Sie die 5 g Korallenprobe in einen sterilen Mörser und zerkleinern Sie sie mit einem sterilen Stößel.
- Mit einem sterilen Pfannenwender wird die zerkleinerte Probe in eine sterile Kulturkolben mit 45 ml 3%-NaCl-steriler Lösung und 10−15 Glasperlen zu je 5 mm übertragen. Verwenden Sie etwas von der 45 ml sterilen Kochsalzlösung, um den Mörtel zu reinigen und die maximale Menge des Macerate zurückzugewinnen.
- Halten Sie die Kolben 16 Stunden lang bei der Wassertemperatur der Probenahme unter konstantem Umrühren (150 x g).
ANMERKUNG: Bei flachen Korallen liegt die optimale Temperatur zwischen 24 und 28 °C. Dieser Schritt trennt Mikroorganismen von verschiedenen Korallenkompartimenten, wie denen, die an den Wirtszellen befestigt sind, oder von denen, die im Gewebe und im Skelett leben. Nach diesem Schritt sollten die Korallenmacerate nicht mehr gelagert werden, und der Isolationsschritt muss sofort ausgeführt werden.
2. Isolierung synthetischer Östrogen-17a-ethinylestradiol (EE2)-abbauenden Bakterien aus Meerwasser und/oder Korallen
- Wähle Bakterien.
ANMERKUNG: Nach den Schritten 1.1.2 und 1.2.7 wird die Konzentration von Mikroorganismen im Meerwasser, die sich von den verschiedenen Korallenmaceraten gelöst haben, unbekannt und variabel sein. Um die Isolierung einzelner mikrobieller Kolonien in Petrischalen mit Agar-Medien zu gewährleisten, sind serielle Verdünnungen erforderlich.- Führen Sie serielle Verdünnungen von bis zu 10–9 in steriler Kochsalzlösung für Korallenproben und bis zu 10–6 für Wasserproben durch. Pipettenverdünnung 5x auf und ab, bevor die Spitze entsorgt wird. Vortex nimmt jedes Mal 5 Sekunden Abtastproben, bevor die nächste serielle Verdünnung durchgeführt wird.
- Pipetten Sie 100 μL jeder Verdünnung auf Petrischalen, die 3 % NaCl Lysogeniebrühe (LB) Agarmedium enthalten, und richten Sie diese an.
ANMERKUNG: Verwenden Sie marine Agar (MA) als alternatives Medium. Dreifache jeder Verdünnung sind für zuverlässige Ergebnisse erforderlich. - Inkubieren Sie die Platten 1−3 Tage lang bei der Zieltemperatur (z. B. 26 °C). Überprüfe die Kennzeichen einmal am Tag.
- Wählen und isolieren Sie die Kolonien, wobei sie unterschiedliche Wachstumsmorphologien auf neuen Platten mit der Streak-Plate-Technik zeigen. Wiederhole diesen Schritt so oft wie nötig, damit reine Kolonien auf den Platten wachsen.
- Wenn das Verfahren nicht sofort bis Schritt 2.3.1 fortgesetzt wird, werden Isolate bei 4 °C oder in Glycerol wie in Abschnitt 2.2 beschrieben gelagert.
- Bereiten Sie Glycerolbrühe vor.
ANMERKUNG: Dieser Schritt ist optional und kann zur langfristigen Lagerung von Bakterienbeständen verwendet werden.- Nehmen Sie einzelne Kolonien von der frischen Platte oder von den bei 4 °C gelagerten Platten und inokulieren Sie sie unabhängig in 2 ml sterilem LB-Medium.
- Setzen Sie die Schläuche über Nacht (150 x g) bei 24−28 °C (ON) unter ständiges Umrühren.
- Fügen Sie 1 ml der Bakterienkulturen aus Schritt 2.2.2 und steriles Glycerol zu einer Endkonzentration von 20 % zu den 2 mL Kryovials hinzu.
- Lass die Kryoviale bei 4 °C EINGESCHALTET.
- Geben Sie die Glycerol-Bakterienbestände bis zum Bedarf bei -80 °C auf.
- Führen Sie den EE2-Degradations-Fähigkeitstest durch.
- Aktiviere die Isolate in LB-Brühe oder alternativen Medien. Dafür nehmen Sie eine einzelne Kolonie aus den frischen Platten oder der bei 4 °C gelagerten Platte und inokulieren Sie 2 ml steriles LB-Medium. Falls es sich um eine Glycerol-Aktie handelt, streicht sie zuerst auf LB-Agarplatten und inkubiert bei 24−28 °C ON, damit einzelne Kolonien wachsen. Stellen Sie das Rohr mit dem LB-Medium unter konstantem Rühren (150 x g) auf 24−28 °C ON an.
- Nach dem Bakterienwachstum pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie bei 8.000 x g für 8 Minuten bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren. Entsorgen Sie das Überlagerungsmittel und lassen Sie die Zellen vorsichtig auf und ab in einem gleichen Volumen (2 ml) salzhaltigem Wasser aufhängen, um die restliche LB-Brühe zu waschen.
- Wiederhole Schritt 2.3.2 zweimal, um sicherzustellen, dass keine Spuren einer Kohlenstoffquelle vorhanden sind, und suspendiere die Zellen in einem gleichen Volumen Kochsalzlösung. Wenn zum Beispiel mit einer 2-mL-Kultur begonnen wurde, sollten die Zellen in einem finalen Volumen mit 2 mL Kochsalzlösung wieder suspendiert werden.
- Inokulieren Sie die gewaschenen und neu suspendierten Zellen in einem minimalen Bushnell Haas-Kulturmedium (BH-Brühe), das EE2 als einzige Kohlenstoffquelle enthält.
ANMERKUNG: EE2 ist in Ethanol mit einer Endkonzentration von 5 mg/L im Kulturmedium gelöst. Ändern Sie bei Bedarf die Art des Schadstoffs und/oder die Konzentration. - Beurteile das Bakterienwachstum anhand der optischen Dichte bei 600 nm und/oder Kolonienbildungseinheiten (CFU) auf dem LB-Agarmedium für 16−72 Stunden Inkubation.
ANMERKUNG: Alternativ können die Mikroorganismen direkt auf minimalen Medien isoliert werden, die EE2 oder andere Verbindungen als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. Dieser Schritt würde die Auswahl steuern und unerwünschtes Wachstum vermeiden.