Selektive Anreicherung und Isolierung ölabbauender Meeresbakterien aus Meerwasserproben

Zusammenfassung

Quelle: Villela, H. D. M. et al. Prospektion mikrobieller Stämme für Bioremediation und Probiotikaentwicklung für die Forschung und Erhaltung von Metaorganismen. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert die selektive Isolierung ölabbauender Meeresbakterien durch Anreicherung von Meerwasserproben auf ölbasierten Medien, was die Rückgewinnung reiner Stämme mit potenziellen Anwendungen in der Rohölbioremediation und Umweltreinigung ermöglicht.

Protokoll

1. Wasser- und Korallensammlung und -lagerung zur mikrobiellen Isolierung

ANMERKUNG: Es ist wichtig, die Koordinaten und Temperatur der Probenahmestellen zu erfassen. Wenn möglich, können Metadaten wie Salzgehalt, pH-Wert, Tiefe und Lichtintensität ebenfalls helfen, fein abgestimmte Kultivierungsansätze und zukünftige Dateninterpretationen zu finden. Für zuverlässige Ergebnisse werden die Proben so lange wie möglich gespeichert. Das Wasser-/Korallenmikrobiom kann sich erheblich verändern, wenn die Proben nicht bei der richtigen Temperatur aufbewahrt und/oder lange gelagert werden. Wird der Isolationsschritt nicht sofort nach der Entnahme durchgeführt, ist es entscheidend, die Proben bis zur Verarbeitung bei 4 °C zu halten. Je länger die Proben gelagert werden, selbst bei 4 °C, desto mehr verändert sich die mikrobielle Gemeinschaft.

1. Probe und lagere Meerwasser.
   1. Sammeln Sie 500 ml Wasserproben in mindestens dreifacher Ausgabe von jedem Zielentnahmeort. Am besten verwenden Sie sterile Flaschen mit Schraubdeckeln.
   2. Wenn das Wasser sofort nach der Abnahme aufbereitet wird, halten Sie die Flaschen für kurze Zeit bei RT (Raumtemperatur). Wenn die Probenverarbeitung später stattfindet, halten Sie die Flaschen bei 4 °C.
2. Probe und lagere die Koralle.
   1. Verwenden Sie eine sterile Zange, um Korallenfragmente von derselben Probenahme wie die Wasserproben zu schneiden. Um eine Kontamination zu vermeiden, sollten Korallen nur mit sterilen Handschuhen berührt werden.
   2. Spülen Sie das entnommene Korallenfragment mit 20 ml steriler Kochsalzlösung (3 % NaCl (Natriumchlorid) im destillierten Wasser) oder künstlichem Meerwasser, um die locker angehefteten freilebenden Bakterien des Meerwassers zu entfernen.
   3. Mit einer Zange wird jedes Korallenfragment in einen sterilen 250−500 mL Behälter mit einem Schraubverschluss mit steriler Kochsalzlösung gegeben.
   4. Im Labor werden mit sterilen Pinzetten und Zangen 5 g Korallenfragmente mit sterilen 100 mm x 20 mm Petrischöpfen auf einer Waage gewichtet.
   5. Geben Sie die 5 g Korallenprobe in einen sterilen Mörser und zerkleinern Sie sie mit einem sterilen Stößel.
   6. Mit einem sterilen Pfannenwender wird die zerkleinerte Probe in eine sterile Kulturkolben mit 45 ml 3%-NaCl-steriler Lösung und 10−15 Glasperlen zu je 5 mm übertragen. Verwenden Sie etwas von der 45 ml sterilen Kochsalzlösung, um den Mörtel zu reinigen und die maximale Menge des Macerate zurückzugewinnen.
   7. Halten Sie die Kolben 16 Stunden lang bei der Wassertemperatur der Probenahme unter konstantem Umrühren (150 x g).
      ANMERKUNG: Für flache Korallen liegt die optimale Temperatur zwischen 24 und 28 °C. Dieser Schritt trennt Mikroorganismen von verschiedenen Korallenkompartimenten, wie denen, die an den Wirtszellen befestigt sind, oder von denen, die im Gewebe und im Skelett leben. Nach diesem Schritt sollten die Korallenmacerate nicht mehr gelagert werden, und der Isolationsschritt muss sofort ausgeführt werden.

2. Isolierung von ölabbauenden Bakterien aus Meerwasser und/oder Korallen

1. Bereiten Sie ein Mindestmedium vor, das eine ölwasserlösliche Fraktion (oWSF) und eine ölwasserunlösliche Fraktion (oWIF) als einzige Kohlenstoffquelle enthält.
   1. Fügen Sie 1−2 % Rohöl zu 500 ml sterilem destilliertem Wasser hinzu. Verwenden Sie einen Filterkolben, der unten geöffnet ist, um die lösliche Fraktion herauszunehmen, ohne die obere Schicht der unlöslichen Fraktion zu stören.
   2. Halten Sie die Mischung bei konstantem Rühren bei 24−28 °C bei 150 x g für 48 Stunden.
   3. Stellen Sie die Filterkolbe mit den Rohölfraktionen auf eine stabile Oberfläche und warten Sie 10−20 Minuten, um lösliche und unlösliche Fraktionen zu trennen.
   4. Übertragen Sie das oWSF in eine neue sterile Flasche und sparen Sie die oWIF, indem Sie den unteren Filterkolben öffnen und die lösliche Fraktion herausnehmen.
   5. Mit dem gesamten im vorherigen Schritt gewonnenen oWSF (~400 mL) bereiten Sie 1 L BH (Bushnell Haas) Agar-Minimummedium mit oWSF als einzige Kohlenstoffquelle vor.
   6. Mit dem aus Schritt 2.1.4 im Kolben verbleibenden oWIF bereiten Sie 1 L BH-Agar-Minimummedium mit oWIF als einzige Kohlenstoffquelle vor.
2. Isolieren Sie oWSF- und oWIF-abbauende Bakterien.
   1. Mit Wasser und Korallenmacerat aus den Schritten 1.1.2 bzw. 1.2.7 verdünnen Sie die Proben auf bis zu 10^–6 in steriler Kochsalzlösung wie unten.
3. Führen Sie serielle Verdünnungen von bis zu 10^–9 in steriler Kochsalzlösung für Korallenproben und bis zu 10^–6 für Wasserproben durch. Pipettenverdünnung 5x auf und ab, bevor die Spitze entsorgt wird. Vortex nimmt jedes Mal 5 Sekunden Abtastproben, bevor die nächste serielle Verdünnung durchgeführt wird.
4. Pipetten Sie 100 μL jeder Verdünnung auf Petrischalen, die BH-oWSF und BH-oWIF Agar-Medien enthalten, und richten Sie diese an.
5. Inkubieren Sie die Platten 1−3 Tage lang bei der Zieltemperatur (z. B. 26 °C). Überprüfe die Kennzeichen einmal am Tag.
6. Wählen und isolieren Sie die Kolonien, wobei sie unterschiedliche Wachstumsmorphologien auf neuen Platten mit der Streak-Plate-Technik zeigen. Wiederhole diesen Schritt so oft wie nötig, damit reine Kolonien auf den Platten wachsen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
500 mL PYREX Medienspeicherflasche	Thomas Scientific/Corning	1743E20/1395-500	Benutzt, um Wasser zu probieren.
500 mL Aspiratorflaschen	Thomas Scientific/Corning	1234B28/1220-2X	Wird verwendet, um die Ölfraktionen zu trennen.
6-Zoll-Drahtschneiderzange	Thomas Scientific/Restek	1173Y64/23033	Wurde verwendet, um Korallenfragmente zu schneiden.
Agar	Himedia	PCT0901-1 KG	Früher wurden feste Medien hergestellt.
Bushnell Haas Brühe	Himedia	M350-500G	Als minimales Medium verwendet, das mit Kohlenstoffquellen ergänzt werden sollte.
Erlenmeyerkolben	Thomas Scientific/DWK Life Sciences (Kimble)	4882H35/26500-125	Wurde verwendet, um Korallenmacerat mit Glasperlen auszubrüten.
Laminarströmungshaube			Musste unter sterilen Bedingungen arbeiten.
Luria Bertani Brühe, Müller (Miller Luria Bertani Brühe)	Himedia	M1245-1KG	Verwendet als reichhaltiges Medium zum Bakterienwachstum.
Marine Agar 2216 (Zobell Marine Agar)	Himedia	M384-500G	Verwendet als reichhaltiges Medium zum Bakterienwachstum.
Orbital-Shaker-Brutkasten			Verwendet zum Inkubieren von flüssigem Medien und Öl.
Platteninkubator			Früher hat ich Teller bebrütet.
Porzellan-Mörser und Stößel	Thomas wissenschaftlich/Vereinigte Wissenschaftliche Versorgung	1201U69/JMD150	Verwendet zum Zerkleinern von Korallenfragmenten.
Gekühlte Zentrifuge			Wird verwendet, um Bakterienkulturen zu zentrifugieren.
Spektralphotometer			Verwendet zur Messung der optischen Dichte von Bakterienkulturen.
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Verwendet für die DNA-Extraktion mikrobieller Stämme.