Verfolgung des Bakterienwachstums bei Einzelzellauflösung in einem mikrofluidischen System

Zusammenfassung

Quelle: Cabeen, M. T., et al. Einzellige mikrofluidische Analyse von Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)

Das Video demonstriert den Einsatz eines mikrofluidischen Geräts zur Beobachtung des bakteriellen Wachstums auf Einzelzellebene. Es zeigt, wie nicht bewegliche bakterielle Zellen, die in mikrogroßen Gräben eingeschlossen sind, kontinuierlich unter einem Fluoreszenzmikroskop genährt und abgebildet werden. Das Setup ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung der Zellteilung und der Linienverfolgung über mehrere Generationen hinweg.

Protokoll

1. PDMS-Geräte-Casting

1. In einer staubfreien Umgebung wird Polydimethylsiloxan (PDMS) Polymer und Härtemittel im Verhältnis 10:1 gemischt und mindestens 10 Minuten unter Vakuum entfettet.
2. Platzieren Sie einen Silizium-Master (oder eine Epoxid- oder Polyurethan-Nachbildung davon) auf ein Stück unbeschiedener Alufolie in einer Polystyrol-Petriplatte. Gieße die entgaste PDMS-Mischung über den Master bis zu einer Tiefe von etwa 5 mm. Entgasen Sie die Petriplatte mindestens 10 Minuten. Verwenden Sie einen sanften Luftstrahl, um Oberflächenblasen zu sprengen.
   ANMERKUNG: Ein Kunststoffreplika-Master kann während der Entgasung teilweise schwimmen; Falls das passiert, drücken Sie die Replik mit einem sauberen Kunststoffapplikator nach unten.
3. Bereite PDMS mindestens 1 Stunde im Ofen bei 60 °C aus und lasse es auf Zimmertemperatur abkühlen. Entfernen Sie die Alufolie mit dem Master- und ausgehärteten PDMS von der Petriplatte. Ziehe vorsichtig die Alufolie von der Rückseite des Masters ab und ziehe dann vorsichtig das PDMS vom Master.
   ANMERKUNG: Alternativ kann PDMS über Nacht bei Zimmertemperatur ausgehärtet werden. Die relative Zerbrechlichkeit eines Siliziumwafer-Masters kann durch die Verwendung von Epoxidklebstoff überwunden werden, um den Wafer dauerhaft an eine 1/16 Zoll dicke Aluminium-Scheibe der gleichen Größe wie der Wafer zu kleben.
4. Da ein Wafer typischerweise mehrere mikrofluidische Geräte mit leicht unterschiedlichen Abmessungen umfasst, schneiden Sie ein einzelnes Gerät mit einem sauberen, scharfen Skalpell auf die richtige Größe.
   ANMERKUNG: Für routinemäßige Bacillus-Subtilis-Arbeiten verwenden Sie Geräte mit 1,0 μm breiten Zellgräben.

2. Geräte-Stanzen und Verbinden

1. Legen Sie ein Stück transparentes Büroklebeband (siehe Materialtabelle) über die gemusterte Seite des Geräts, um die Sichtbarkeit der gemusterten Merkmale zu verbessern. Die Ein- und Auslassöffnungen sind als kreisförmige Bereiche an gegenüberliegenden Enden der sichtbaren fluidischen Kanäle gekennzeichnet (Abbildung 1). Um die Sichtbarkeit beim Lochen für Ein- und Auslassstifte zu verbessern, markieren Sie die Ein- und Auslässe mit Punkten mit einem fein gespitzten Marker.
   ANMERKUNG: Um sicherzustellen, dass Ein- und Auslassstifte nicht überfüllt sind, werden alle anderen Kanäle gelocht, beginnend mit dem Kanal direkt unter der alphabetischen Bezeichnung des Geräts.
2. Drehen Sie das PDMS-Gerät so, dass die gemusterte Seite nach unten ist, und stechen Sie mit einem 0,75-mm-Biopsiestanzer durch das Gerät zu den markierten Punkten; Entsorge die Stanzungen.
   ANMERKUNG: Die Geräte werden mit der gemusterten Seite nach unten gestanzt, da das durch die Biopsiestanz erzeugte Loch typischerweise leicht ausgeweitet ist, wo der Stanz in das Polymer eintritt. Das Stanzen des Geräts in umgekehrter Richtung stellt sicher, dass das Loch auf der gemusterten Seite einen scharfen Rand hat.
3. Mit einem Stereomikroskop stellen Sie sicher, dass die gestanzten Löcher mit den Ein- und Auslassbereichen des Geräts überlappen. Verwenden Sie eine fein gespitzte Pinzette, um überflüssige PDMS-Fragmente aus den gestanzten Löchern zu entfernen.
4. Verwenden Sie Klebeband, um Staub von beiden Seiten des Geräts zu entfernen und legen Sie es in eine saubere Polystyrol-Petriplatte. Bereiten Sie ein 22 mm x 40 mm großes Deckglas vor, indem Sie es mit 100 % Isopropylalkohol benetzen und mit einem Reinraum-Tuch reiben; trocken mit einem Strom staubfreier Luft oder Stickstoff.
5. Legen Sie die gelochte PDMS-Funktionsseite nach oben zusammen mit dem gereinigten Abdeckungsglas in einen Sauerstoffplasmareiniger.
   1. Plasmabehandle das Gerät mit folgenden Einstellungen: Vakuum, 70 mTorr; O₂-Druck, 200 mTorr; Dauer, 15 S; Strom, 30 W. Unmittelbar nach Ablauf der Plasmabehandlungsphase wird das Gerät und das Abdeckungsglas vom Plasmareiniger entfernt.
   2. Kehren Sie das PDMS um und platzieren Sie es in der Mitte des Deckglases, sodass die gemusterte Seite das Glas berührt; Stellen Sie sicher, dass die Zuführungskanäle (die zwischen Ein- und Auslassbereich verlaufen) mit der Längsachse des Abdeckungsglases ausgerichtet sind. Drücke sehr sanft nach unten, damit das PDMS gegen das Glas abdichtet.
6. Backen Sie das zusammengebaute Gerät mindestens 1 Stunde im Ofen bei 60 °C. Nach dem Backen überprüfen Sie manuell, ob das PDMS mit dem Glas verbunden ist, indem Sie sanft auf eine Ecke des Geräts drücken.
   ANMERKUNG: Sobald das Gerät gebunden ist, sollte es innerhalb von 24 Stunden verwendet werden, da das Polymer mit zunehmender Zeit nach der Plasmabehandlung zunehmend hydrophob wird.

3. Mikrofluidische Sanitärvorbereitung

1. Schneiden Sie die Längen des Polymerrohrs (Innendurchmesser (ID) 0,02 Zoll, Außendurchmesser (OD) 0,06 Zoll) auf geeignete Längen, um von der Spritzenpumpe zum Schaltgerät (falls verwendet) und zum Gerät zu erreichen, wenn es am Mikroskop montiert ist. Schneide so viele Längen, wie es Mikrofluidik-Bahnen gibt.
2. Bauen Sie Y-Übergänge für Klemmventile (falls vorhanden) zusammen, indem Sie 2 cm lange flexible Silikonrohre (0,03 Zoll Innendurchmesser, 0,065 Zoll Überdurchmesser) an den oberen Widerhaken des "Y" und 1 cm lange Silikonrohre am unteren Widerhaken des "Y" anbringen.
3. Schneiden Sie 10 cm (oder geeignete) Polymerrohre ab; Verbinden Sie sie an einem Ende mit der Schalterverbindung, indem Sie sie in die 1 cm großen Silikonrohrsegmente am unteren Barb des "Y" einführen. Verbinden Sie sie am anderen Ende mit 21G-Nadeln, die von ihren Kunststoff-Spritzenadaptern entfernt und etwa um 90° bzw. 9 mm vom Nadelende gebogen wurden.
4. Verbinden Sie 21G-stumpfe Nadeln an einem Ende der Rohrsegmente, die von den Spritzen zum Schalter führen, indem Sie die Nadeln in den Schlauch einführen. Führen Sie die anderen Enden jeder Rohrlänge in die Silikonrohrsegmente an den Einlassbarben der Y-Übergänge ein.
   ANMERKUNG: Verwenden Sie eine Art Vorrichtung, um die Klemmventile und Verbindungen an Ort und Stelle zu halten; diese kann leicht aus einer Mikropipettenspitzenbox hergestellt werden (Abbildung 2D).
5. Schneiden Sie Längen von Polymerrohren, um Abfälle vom Ausgang des Geräts zu einem Abfallbecher zu transportieren. Verbinden Sie sie an einem Ende mit gebogenen 21-G-Nadeln, die wie oben beschrieben vorbereitet sind. Klebe das andere Ende der Röhren in einen Abfallbecher ein.
6. Bereiten Sie geeignete Mengen an Medien mit 0,1 mg/mL Bovines Serumalbumin (BSA) vor und füllen Sie die gewünschte Größe und Anzahl der Spritzen. Verbinden Sie die BSA-geladenen Spritzen mit den vorbereiteten 21G-Nadeln, die am Einlassrohr befestigt sind, und laden Sie die Spritzen in die Spritzenpumpen.
   ANMERKUNG: Für typische Experimente werden 5 Kanäle des Geräts verwendet, jeweils mit einer 20-ml-Spritze. Ein Experiment, bei dem das Medium gewechselt wird, benötigt zwei Bänke mit jeweils 5 Spritzen. Hier wird die Pumpe mit der ersten Bank als Phase-1-Pumpe bezeichnet, und die Pumpe mit der zweiten Bank mit dem Post-Schalt-Medium als Phase-2-Pumpe.
7. Reinigen Sie die Luft aus der Einlassleitung, indem Sie die Spritzenpumpen mit hoher Durchflussrate (>500 μL/min) betreiben, beginnend mit vertikaler Ausrichtung der Spritzenpumpen und dem Anklopfen der Spritzen, um Luftblasen nach oben zu bringen. Sobald die Luft aus den Spritzen gespült wurde, stellen Sie die Spritzenpumpe horizontal ab und tippen oder schnippen Sie schrittweise die Polymerleitungen von den Spritzen durch die Schaltvorrichtung, um Luftblasen zu lösen und zu spülen. Wiederhole diesen Vorgang für die zweite Spritzenbank (wenn du das Medium wechselst).
8. Nachdem die Luftblasen gespült wurden, stellen Sie die Phase-2-Spritzenpumpe (d. h. mit dem Medium, das als zweites nach dem Schalter verwendet wird) auf 1,5 μL/min ein und pausieren Sie dann den Durchfluss. Platzieren Sie kleine Binderclips auf die Segmente des flexiblen Rohrs am Ast der Y-Übergänge, die der zweiten Mittelphase entsprechen. Lassen Sie die Phase-1-Spritzenpumpe mindestens 30 Minuten mit einer moderaten Durchflussrate (z. B. 10 μL/min) laufen, um das zweite Medium aus dem Einlassrohr unterhalb der Y-Verbindung zu spülen.

4. Zellkulturvorbereitung

1. Über Nacht eine Vorkultur des interessierten Stamms im gewünschten Medium entwickeln, bis zur stationären Phase. Der Bakterienstamm sollte eine Mutation enthalten, die die Zellen unbeweglich macht, sodass die Zellen nicht aus den Kanälen des Geräts schwimmen.
   ANMERKUNG: In diesem Protokoll besteht der bakterielle Stamm aus B. subtilis 3610, der eine Hexen-A233V-Substitution enthält (diese Mutation bewirkt, dass das Flagell gerade statt helikal wird, was die Zellbeweglichkeit verhindert), einen PrsbV-mNeonGreen-Reporter für Zellstress und einen konstitutiven Phyperspank-mNeptune (roten) Reporter zur Hervorhebung der Zellen. Luria-Bertani (LB) Lennox-Medium wird im Beispielprotokoll verwendet. Typische Stämme für Mikrofluidik-Experimente enthalten einen oder mehrere fluoreszierende transkriptionelle Reporter und ein konstitutiv produziertes, zytoplasmatisch fluoreszierendes Protein zur automatischen Zelldetektion. Wachstumsdefekte wurden nicht beobachtet, wenn das LB Lennox-reiche Medium verwendet wurde, aber das Wachstum von B. subtilis in minimalen Medien kann unter mikrofluidischen Bedingungen gehemmt werden, da sekretierte Siderophore vom Mediumfluss weggespült werden. Unter solchen Umständen kann das Wachstum durch die Zugabe von Natriumcitrat und Eisenchlorid zum Medium wiederhergestellt werden, wie für das Medium S750 gemeldet.
2. Am Morgen des Experiments verdünnen Sie die B.-subtilis-Zellen 1:50 Uhr in eine verdeckte 250-ml-Flasche mit 25 mL Wachstumsmedium. Wachsen Sie die Zellen 5 bis 6 Stunden in einer Schüttelkultur bei 37 °C bis zu einer optischen Dichte von mehr als 1.
   ANMERKUNG: Eine dichte Zellkultur ist vorzuziehen, da die stationären B.-subtilis-Zellen kleiner sind und seltener in Zellketten vorkommen, was die Gerätebelastung erleichtert. Verschiedene Bakterienarten benötigen möglicherweise andere Medien oder Wachstumsbedingungen für eine optimale Belastung.
3. Mit einer Spritze, die mit einem 5-μm-Porenfilter ausgestattet ist, filtern Sie etwa 15 ml Zellkultur in ein 15-mL konisches Rohr, um B.-subtilis-Zellketten zu entfernen (dies ist für E. coli unnötig und bei anderen Arten möglicherweise nicht notwendig).
   ANMERKUNG: Relativ wenige Zellen sollten entfernt werden; Das Filtrat sollte trüb sein.
4. Zentrifugieren Sie die gefilterte Kultur für 10 Minuten bei 4.000 x g bei Raumtemperatur. Gießen Sie das Überstandsmittel ab und lassen Sie das Zellpellet in der verbliebenen Restflüssigkeit im Rohr wieder suspendieren, wobei Sie bei Bedarf etwa 500 μL frisches Medium hinzufügen, um das Pipetieren der Zellsuspension zu erleichtern.

5. Geräteladen

1. Setzen Sie vorsichtig leere, dünne, gelgeladene Mikropipettenspitzen (siehe Materialtabelle) in die Auslasslöcher des mikrofluidischen Bauteils.
2. Mit dünnen Gel-Ladespitzen und einer P200-Mikropipette passivieren Sie das Gerät, indem ein Medium mit 1 mg/mL BSA in die Einlasslöcher injiziert wird, wobei die Spitzen in den Auslasslöchern beobachtet werden, um die Befüllung der mikrofluidischen Kanäle zu überwachen (Abbildung 2A). Inkubieren Sie das Gerät etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur.
   ANMERKUNG: BSA wird häufig als Blockier- oder Passivierungsmittel verwendet, das an die hydrophobe Oberfläche des PDMS-Polymers bindet, dessen Hydrophilität erhöht und die Bindung anderer Proteine oder von Zellen (über Zelloberflächenmoleküle) reduziert.
3. Mit dünnen Gel-Ladespitzen wird jeder Kanal mit den resuspendierten Zellen (aus Abschnitt 4) geladen und mit den Spitzen im Auslasskanal den Verlauf der Zellen durch das Gerät überwacht (Abbildung 2B).
   ANMERKUNG: Die Belastung wird erleichtert, indem die P200-Mikropipette auf ihr maximales Volumen von 200 μL eingestellt und dann ein Luftkissen eingesaugt wird, bevor ein kleines Volumen (etwa die Hälfte des Volumens des dünnen Schnitts der Pipettenspitze) von Zellen aspiriert wird. Das Volumen der resuspendierten Zellen muss nicht genau sein, da das Volumen des PDMS-Geräts im Vergleich zur Mikropipette klein ist. Wir kennen keine Obergrenze für die Dichte der resuspendierten Zellen, solange die Zellsuspension in das Gerät pipettiert werden kann. Zellklumpen können das Gerät verstopfen und sollten durch gründliches Pipetteren und/oder Wirbelmischung vermieden werden.
4. Entfernen Sie vorsichtig die Gel-Ladespitzen aus den Auslasslöchern und arbeiten Sie einzeln, um Schäden am Gerät zu vermeiden.
5. Zentrifugiere das Gerät in einer Mikrozentrifuge auf der Werkbank mit einem geeigneten Rotoradapter bei etwa 6.000 x g für 10 Minuten (Abbildung 2C).
   ANMERKUNG: Ein maßgefertigter Aluminiumrotoradapter, der für einen Mikrozentrifugenrotor konzipiert wurde (Abbildung 2C), wurde verwendet; Verschiedene Zentrifugenmodelle können mit geeigneten Rotoradaptern verwendet werden. Das wichtige Merkmal des Adapters ist, dass er seitliche Kraft in Richtung der geschlossenen Enden der Zellgräben ausübt und dadurch die Zellen in die Seitenkanäle zwingt.
6. Überprüfen Sie eine erfolgreiche Ladung unter dem Mikroskop (Abbildung 3), jedoch ohne das Gerät am Schlittenhalter/Stufeneinsatz zu befestigen.
   ANMERKUNG: In diesem Protokoll wird ein 60X, 1,4 NA Ph3 Ölimmersionsobjektiv sowohl für die Verifikation in dieser Phase als auch für die anschließende Bildgebung verwendet.

6. Gerätemontage, Gleichgewicht und Montage

1. Befestigen Sie das geladene Gerät vorsichtig auf einem Bühneneinsatz, indem Sie das Deckglas an beiden Seiten des PDMS an die Unterseite des Bühneneinsatzes kleben (d. h. den Bühneneinsatz umdrehen, bevor das Gerät befestigt wird). Kehren Sie die Stufeninsert-Geräte-Baugruppe so um, dass das PDMS nach oben zeigt, und legen Sie es auf eine weiche Oberfläche, wie z. B. einen staubfreien Wipe (Abbildung 2D).
2. Stellen Sie die Durchflussrate der Phase-1-Spritzenpumpe auf 35 μL/min an. Mit einer Spur nach der anderen führt man die Einlassnadel und dann die Auslassnadel ein (d. h. führt zum Abfallbecher; Abbildung 2E).
3. Wischen Sie überschüssiges Medium mit einem sauberen, staubfreien Tücher ab und überprüfen Sie das Gerät visuell auf Undichtigkeiten. Untersuchen Sie das Auslassrohr auf das Erscheinungsbild überschüssiger Zellen (typischerweise als trüber Streifen) und den mittleren Meniskus, der sich langsam zum Abfallbecher bewegt.
4. Lassen Sie das Gerät etwa 15 bis 30 Minuten mit 35 μL/min laufen, bis alle angeschlossenen Bahnen in den Abfallbecher abfließen.
5. Stellen Sie die Phase-1-Spritzenpumpe auf 1,5 μL/min ein und pausieren Sie den Durchfluss. Bringen Sie die gesamte Pumpe und das Gerät zum Mikroskop (dieser Prozess wird durch das Platzieren auf einen rollenden Wagen erleichtert) und starten Sie den Phase-1-Mediumfluss mit 1,5 μL/min wieder. Setzen Sie das Bühneneinsatz vorsichtig mit dem Gerät auf ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop und verwenden Sie bei Bedarf Klebeband zum Führen des Ein- und Auslaufrohrs.
6. Finden Sie die gewünschten Positionen auf dem Gerät für die Bildgebung und beginnen Sie mit der Bildgebung wie gewünscht. Beachten Sie, dass Zellen typischerweise einige Stunden (etwa 10 Generationen) benötigen, um ein gleichmäßiges exponentielles Wachstum zu erreichen, und der Beginn der Bildaufnahme kann sich entsprechend verzögern, sodass die Bildgebung nach der Gleichgewichtsphase beginnt.
   ANMERKUNG: Das stationäre Wachstum von Zellen, die in exponentialer Phase gehalten werden, sollte bei der nachfolgenden Bildanalyse durch Verfolgung der Zellteilungszeiten überprüft und sichergestellt werden, dass sie einen konstanten Minimalwert erreicht haben.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schaltplan des mikrofluidischen Bauelements. Ein Geräteschaltplan wird ungefähr maßstabsgetreu dargestellt. Die alphabetische Bezeichnung ist zusammen mit den Einlass- und Auslasszonen beschriftet, die gestanzt sind, um die stu...

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