Beurteilung der bakteriellen Beweglichkeit mit einem mikrofluidischen Gerät

Zusammenfassung

Quelle: Scheidweiler, D., et al. Die Kombination von fluidischen Geräten mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video demonstriert den Einsatz eines mikrofluidischen Geräts zur Quantifizierung der bakteriellen Beweglichkeit durch eine poröse Matrix, die aus zufällig angeordneten Säulen besteht. Fluoreszierend markierte Bakterien werden in das Gerät eingeführt, mikroskopisch fotografiert, während sie durch die poröse Matrix in den Beobachtungskanal gelangen, und analysiert, um eine Durchbruchkurve (BTC) zu erzeugen.

Protokoll

1. Bedingungen der Bakterienkultur

1. Unter einer laminaren Flusshaube verwenden Sie 100 μL eines Glycerollagers aus grünem fluoreszierendem Protein (GFP)-markierten Pseudomonas putida KT2440 (1 × 10^{7 mL-1}, gelagert bei -80 °C), um 5 mL Luria-Bertani (LB)-Medium zu inokulieren. Inkubieren Sie bei 30 °C und schütteln Sie über Nacht bei 250 U/min.
2. Am nächsten Tag wird 100 μL der Übernachtkultur in 5 mL LB-Medium wieder suspendiert und unter denselben Bedingungen 5 Stunden (exponentielle Phase) inkubiert. Probe ein 1 mL Aliquot in ein 2 mL Rohr, lasse es auf Raumtemperatur (~15 min) abkühlen und zentrifugiere (2300 x g für 5 Minuten).
3. Entferne das Supernatant und gib dem Pellet 1 ml Motilitätspuffer hinzu. Vortex kurzzeitig, um die Probe zu homogenisieren. Verdünnen, um die gewünschte Zellkonzentration zu erreichen, z. B. 5 x 10^{× 5 mL-1}.
4. Für Experimente mit natürlichen Gemeinschaften, wie etwa solchen, die aus Bächen stammen, bereiten Sie ein nicht-selektives Anbaumedium vor. Verwenden Sie beispielsweise sterilgefiltertes und autoklaviertes Bachwasser oder ein künstliches Flussmedium, das mit einer komplexen Kohlenstoffquelle (LB-Medium) ergänzt wird.

2. Herstellung eines mikrofluidischen Bauteils in Polydimethylsiloxan (PDMS)

1. Entwerfen Sie die gewünschte poröse Geometrie mittels computergestützter Zeichensoftware (CAD), die aus einer Matrix von Kreisen (also dem undurchlässigen Hindernis für die Strömung) besteht, beschrieben durch Radiusgröße und Mittelkoordinaten.
   HINWEIS: Ein Beispiel für eine poröse Geometrie mit zufällig generierten Korn- und Porengrößen ist in Abbildung 1A dargestellt. Ein Beobachtungskanal ohne Hindernisse nahe dem Ausgang erleichtert das Erreichen von Durchbruchkurven (BTCs).
2. Basierend auf der gewählten Geometrie wird eine Form mit der Standard-SU-8-Photolithographie vorbereitet.
   HINWEIS: Alternativ können Formen auch bei einer speziellen Mikrofertigungsanlage bestellt werden. Um einen heterogenen Flüssigkeitsfluss in der horizontalen Ebene zu erzielen, ist es wichtig, die Dicke der Mikrofluidikkammer in derselben Größenordnung wie die durchschnittliche Porenhalsgröße zu entwerfen. Achten Sie jedoch darauf, dass die Abmessungen des mikrofluidischen Geräts für die Beobachtung unter dem Mikroskop geeignet sind (z. B. Arbeiten an Objektträgern).
3. Bereiten Sie 50 g PDMS vor, indem Sie 10 % des Querverschlusses (Dimethyl, Methylhydrogen-Siloxan-Copolymer) zu 90 % des Elastomers nach Gewicht hinzufügen, mit einer Spritze ohne Nadel. Arbeiten Sie unter sauberen Bedingungen und vermeiden Sie Staub so gut es geht. Mischen Sie die beiden Reagenzien in einem sauberen, einwegigen Behälter und legen Sie 30 Minuten lang Vakuum (100 mbar) auf, um gelöste Luft und Blasen aus dem viskosen PDMS zu entfernen.
4. Geben Sie die Form in eine Petrischale (100 mm Durchmesser, 15 mm hoch). Gieße das PDMS auf die Form bis zur gewünschten Höhe (z. B. 2–5 mm). Decken Sie die Petrischale ab und lassen Sie sie 4 Stunden (über Nacht für dickere Schichten) bei 60 °C halten, damit sie aushärtet.
   HINWEIS: Für Visualisierungszwecke sollte Licht durch das PDMS hindurchfließen können; daher ist eine dünne Schicht zwischen 2 mm und 5 mm wünschenswert. Dickere Schichten (>5 mm) verringern die Transparenz des Geräts, und dünnere Schichten werden während der Anwendung verformt.
5. Entferne die Form aus dem Ofen und lasse das Mikrofluidikgerät auf Zimmertemperatur abkühlen. Sobald es abgekühlt ist, entferne vorsichtig den gewünschten Teil des PDMS mit einem Skalpell.
   HINWEIS: Starke Drucke auf die Form führen zu Rissen. Berühren Sie das PDMS nicht mit bloßen Händen, da Fingerabdrücke die optische Transparenz beeinflussen.
6. Versiegeln Sie vorübergehend den Boden des PDMS-Kanals (wo die gewünschte Geometrie graviert wurde) mit Klebeband. Mit einem 0,5 mm Durchmesser Biopsie-Puncher wird der Mikrofluidikkanal durchbohrt, um einen Einlass und einen Auslass zu schaffen, der an das 0,5 mm (Innendurchmesser) Rohr passt.
   HINWEIS: Die weiche Natur von PDMS sorgt für Spannung, sobald das Schlauch eingesetzt wird. Ein- und Auslasskanäle können nach dem Abdichten des PDMS nicht mehr am Glas hergestellt werden.
7. Versiegeln Sie den mikrofluidischen Kanal mittels Sauerstoffplasma-Bindung mit dem Hochfrequenzgenerator (Plasmabinder, Materialtabelle). Dafür reinigen Sie einen Silikatglas-Objektträger (25 mm x 75 mm) mit Ethanol und lassen Sie ihn trocknen. Entferne das Band vom PDMS-Kanal und platziere den Kanal mit der porösen Seite nach oben. Behandle den Silikatglas-Objektträger und die PDMS-Oberflächen bei Raumtemperatur etwa 45 Sekunden lang mit Plasma.
8. Legen Sie den PDMS-Kanal auf den Silikatglas-Träger und erhitzen Sie ihn 30 Minuten lang auf einer heißen Platte bei 100 °C.
9. Nimm das mikrofluidische Gerät von der Heizplatte und kühle es auf Raumtemperatur ab. Schließen Sie den PDMS-Kanal-Einlass mit einem Rohr an. Trage 30 Minuten ein Vakuum an, um Luft aus dem PDMS zu entfernen, das fast undurchlässig für Flüssigkeiten, aber durchlässig für Gas ist.
10. Bereiten Sie 100 ml Motilitätspuffer (10 mM Kaliumphosphat, 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), ergänzt mit 1 % w/v Glukose, pH 7,0) vor und injizieren Sie 1 ml davon mit einer Spritzenpumpe, die mit 10 μL ^Min-1 betrieben wird, in das Mikrofluidikgerät.
    HINWEIS: Da das PDMS durch den vorherigen Vakuumschritt untersättigt ist, verschwinden die Blasen innerhalb von ~30 Minuten.

3. Analyse des bakteriellen Transports mit PDMS-Mikrofluidikgeräten

1. Platzieren Sie das zuvor mit dem Motilitätspuffer gesättigte PDMS-Mikrofluidikgerät auf die Mikroskopstufe. Verwenden Sie Klebeband, um das Rohr zu fixieren und so eine Störung des Flusses während der Stufenbewegung zu minimieren.
2. Stellen Sie die Mikroskopstufe in den Beobachtungskanal in der Nähe des Auslasses. Mit Hellfeldmikroskopie oder Phasenkontrast fokussieren Sie sich auf das Zentrum des Beobachtungskanals und passen die Vergrößerung an, um einzelne Bakterienzellen sichtbar zu machen.
3. Stellen Sie die Lichtwegeinstellungen auf Fluoreszenzmikroskopie um und passen Sie die Belichtungszeit der Kamera an, um einzelne Bakterienzellen (z. B. 100 ms) aufzulösen oder so, dass die Fluoreszenzsignale der Zellen mindestens dreimal stärker sind als das Hintergrundrauschen.
4. Als Nächstes wird das Einlassrohr in ein 2-mL-Rohr mit der bakteriellen Suspension eingeführt. Drehen Sie die Pumpenrichtung um und beginnen Sie, die Federung mit einer Durchflussrate von 1 μL Min-1 zurückzuziehen.
5. Scannen Sie den Querschnitt des gesamten Beobachtungskanals und nehmen Sie alle 2 Minuten ein zusammengesetztes Bild über die gesamte Dauer des Experiments auf.

Ergebnisse

Abbildung 1: Fluidische Geräte zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien (A) Abbildung eines aus Poly(Methylmethacrylat (PMMA) gemahlenen Fluidikgerät. Die poröse Matrix wird in die Grundschicht des Geräts gefräst und d...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma
Elastomer Sylgard 184	Dowsil	101697
Durchflusszytometer NovoCyte	Acea
Traubenzucker	Sigma		https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit
Luria-Bertani (LB) Brühe	BD
Flüssigkeitsspender, XY Plotter Roboter-Kit	Makeblock
Microscope Axio Imager	Zeiss
Microscope AxioZoom v16	Zeiss
Mikroskopobjektträger, 75 mm × 25 mm	Corning
Minipuls 3 Peristaltikpumpe	Gilson
Plasmabinder Corona SB	BlackHole-Labor
Kaliumphosphat	Sigma
Spritzenpumpe New Era NE 4000	Neue Ära
Syto 13 Grüne fluoreszierende Nukleinsäurefärbung	Molekulare Sonden, Invitrogen
Tygon-Rohr	Ismatec
WF31SA Universalfräsmaschine	Mikron