Transfektion eines induzierbaren Genexpressionssystems in Zellen, die ein bakterielles Effektorprotein exprimieren

Zusammenfassung

Quelle: Berens, C. et al. Anwendung eines induzierbaren Expressionssystems zur Untersuchung der Interferenz bakterieller Virulenzfaktoren mit der intrazellulären Signalübertragung. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video demonstriert die Verwendung eines induzierbaren Expressionssystems, um zu bestimmen, wo das bakterielle Effektorprotein CaeB die apoptotische Kaskade des Wirts stört. Es beschreibt die Schritte zur Transfektierung von CaeB-exprimierenden Zellen mit einem tetracyclin-responsiven System, um eine pro-apoptotische Genexpression zu induzieren und so den Bruchpunkt innerhalb der Kaskade zu identifizieren.

Protokoll

1. Transfektion der stabilen Zelllinie mit dem induzierbaren Expressionsvektorsystem

1. Säen menschliche embryonale Niere (HEK)293 Zellen, die stabil grünes fluoreszierendes Protein (GFP) oder GFP-CaeB in einer 12-Well-Platte mit einer Dichte von 1 x 10^{5 Zellen pro} Welle exprimieren.
2. 19 Stunden nach der Aussaat ko-transfektieren Sie die Zellen mit dem Regulator-Plasmid und dem Response-Plasmid, entweder kodierend für Bax oder aktivierte Caspase 3.
   1. Kotransfektiere die stabilen HEK293-Zellen mit 100 ng pWHE125-P-Regulatorplasmid (Abbildung 1) und 100 ng der Antwortplasmide pWHE655-hBax oder pWHE655-revCasp3 (Abbildung 2) sowie 0,4 μl Polyethylenimin.
   2. Bereite das Desoxyribonukleinsäure (DNA) und das Polyethylenimin-Transfektionsreagenz jeweils in 75 μl Opti-MEM-Medium vor und inkubiere genau 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Für die Komplexbildung inkubieren Sie beide Mischungen gemeinsam 15 Minuten bei RT.
3. Gib die Polyethylenimin/DNA-Lösung tropfweise zu den Zellen und inkubiere bei 37 °C in 5 %_CO2.

2. Einleitung der Apoptose

1. 5 Stunden nach der Transfektion wird die Expression der pro-apoptotischen Proteine durch Zugabe von 1 μg/ml Doxycyclin zum Kulturmedium induziert. Zellen 18 Stunden lang bei 37 °C in 5 %_CO2 inkubieren.

Ergebnisse

Abbildung 1. Schematische Übersicht des regulatorischen Plasmids pWHE125. Elemente, die für die Vermehrung in Bakterien wesentlich sind, darunter ein Replikationsursprung (ori pBR) und eine Antibiotikaresistenzkassette gegen Ampicillin...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Lebenstechnologien	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Pen/Strep	Lebenstechnologien	15140-122
OptiMEM	Lebenstechnologien	51985
X-tremeGEN 9	Roche	6365752001
Polyethylenimin	Polyscienes	23966
Doxycyclin	Sigma Aldrich	D9891