Kontinuierliche Überwachung biologischer Rauschen in Bakterien mittels Zeitraffermikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Chaimovitz, E. A. et al. Kontinuierliche Messung des biologischen Rauschens in Escherichia coli mittels Zeitraffermikroskopie. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video demonstriert die Echtzeitvisualisierung biologischer Rauschen in E. coli, indem Schwankungen der GFP-Fluoreszenz während des Bakterienwachstums und der Teilung mittels Zeitraffermikroskopie verfolgt werden.

Protokoll

1. Vorbereitung der Probe für die mikroskopische Bildgebung
   1. Nimm die Flasche aus dem Wasserbad. Wischen Sie die Außenseite der Flasche sauber und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (25 °C) abkühlen.
      ANMERKUNG: Entferne die Flasche etwa 3 Minuten vor Ablauf des Timers.
   2. Gießen Sie ständig 3 ml des Gels in einer kreisförmigen Bewegung an den Rand der Platte. Lass es ein paar Minuten fest werden.
   3. Versiegeln Sie die Platten mit Klebeband und stechen Sie mehrere Löcher mit einer 25-G-Nadel ein. Drehen Sie alle Teller um, damit kein Wasserkondenswasser auf das Gel tropft.
   4. Inkubieren Sie alle Schalen bei 4 °C für 30 Minuten, um eine vollständige Verfestigung zu ermöglichen und gleichzeitig eine Zellmitose zu verhindern.
      ANMERKUNG: Lassen Sie die Proben bei 4 °C für aufeinanderfolgende Messungen, nicht länger als einen Tag.
   5. Starten Sie das Mikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   6. Finde den Anfangsfokus mit dem Objektiv mit der niedrigsten Verstärkung und aktiviere das automatische Fokussystem (AFS).
   7. Verwenden Sie bei Bedarf Öl, betränken Sie das Objektiv mit Öl und verteilen Sie es vorsichtig, indem Sie die Platte mit einem Plattformcontroller bewegen (nicht manuell), und AFS kann wieder aktiviert werden.
   8. Verwenden Sie den relativen Querschnitt in Z-Richtung und folgen dem Standardvorschlag für Z-Schritt-Querschnitte.
      ANMERKUNG: Machen Sie alle 5 Minuten Hellfeldbilder und alle 20 Minuten fluoreszierende Bilder. Manchmal muss der Fokus in den ersten 30 Minuten angepasst werden. Das Vorheizen des Mikroskop-Inkubatorkastens und das Öl während des Kühlens der Probe hilft, den anfänglichen Fokusverlust zu verringern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
35-mm-Glasschüssel	Mattek	P35G-0.170-14-C	Die Dicke entspricht der Mikroskoplinse.
Agarose	Lonza	5004	LB-Vorbereitung
Eclipse Ti	Nikon		Invertiertes Mikroskop
Immersol 518F	Zeiss	4449600000000	Immersionsöl
Parafilm-Band	Bemis	PM-996	Im Text als Band bezeichnet