Nachweis der Zielenzymexpression in genetisch veränderten bakteriellen Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Kim, H. et al., Multi-Enzym-Screening mit einem Hochdurchsatz genetischen Enzym-Screening-System. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert eine genetische Screening-Methode zur Erkennung der Enzymexpression unter Verwendung metagenomischer Fosmidbibliotheken und chromogener Substrate. Die Durchflusszytometrie identifiziert und isoliert einzelne Zellen, die farbige Produkte produzieren, was eine Hochdurchsatzselektion aktiver enzymexpressiver Zellen ermöglicht.

Protokoll

1. Vorbereitung der Metagenomic Library mit einem genetischen Enzym-Screening-System zur Detektion von p-Nitrophenol (pNP) (pNP-GESS)
   1. Konstruiere eine metagenomische Bibliothek in Escherichia coli mit einem Fosmid-Vektor mit einem Fosmid-Bibliotheksproduktionskit.
   2. Aliquot 100 μl der Bibliothek zur Speicherung bei −70 °C, was eine Quelle metagenomischer Bibliothekszellen ist.
      ANMERKUNG: Die optische Dichte einer Probe, gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD₆₀₀) dieses Bibliotheksbestands, beträgt etwa 100.
   3. Taue 100 μl der metagenomischen Standardbibliothek auf Eis auf und inokuliere in einer 500-ml-Flasche mit 50 ml Luria-Bertani (LB) und 12,5 μg/ml Chloramphenicol, gefolgt von einer 37 °C-Inkubation für 2 Stunden.
   4. Entnehmen Sie die Zellen in einem 50 ml konischen Rohr durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 20 Minuten bei 4 °C.
   5. Das Pellet schnell wieder in 50 ml eiskaltem destilliertem Wasser (DW) auflösen und erneut bei 1.000 x g 20 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.
   6. Das Pellet in 50 μl eiskaltem DW mit 10 % (v/v) Glycerol wieder suspendieren. Verwenden Sie 50 μl dieser Zellaliquot für die Elektroporation.
   7. Geben Sie die Mischung aus elektrokompetenten Zellen 50 μl und pGESS(E135K) DNA (100 ng) in eine eiskale Elektroporationscuvette und elektroporieren (1,8 kV/cm, 25 μF) das Gemisch.
   8. Fügen Sie schnell 1 ml super optimale Brühe mit Katabolit-Repressionsmedium (SOC) hinzu und suspendieren Sie die Zellen vorsichtig wieder.
   9. Die Zellen werden mit einer Pipette in ein 14 ml Rundbodenrohr übertragen und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert.
   10. Verteilen Sie 500 μl der geborgenen Zellen auf einer LB 20 x 20 cm großen quadratischen Platte mit 12,5 μg/ml Chloramphenicol und 50 μg/ml Ampicillin. Den Teller 12 Stunden bei 30 °C bebrüten.
   11. Kratzen Sie die Kolonien mit einem Zellschaber ab und sammeln Sie die Zellen in einem 50 ml konischen Rohr mit eiskalten Zelllagermedien.
   12. Zentrifugieren Sie bei 1.000 x g für 20 Minuten bei 4 °C. Setzen Sie das Pellet in 10 ml Eis-Kaltzellen-Speichermedium auf, um einen OD₆₀₀ von 100 zu erreichen.
   13. Aliquot 20 μl der Zellen zur Speicherung bei −70 °C.
        
2. Entfernen von Fehlalarmen aus der Metagenomic Library
   1. Tauen Sie die Standard-metagenomischen Bibliothekszellen (ab Schritt 1.13), die metagenomisches DNA-Fosmid und pGESS(E135K) enthalten, auf Eis.
   2. Inokulieren Sie 10 μl der Zellen in 2 ml LB mit 50 μg/ml Ampicillin und 12,5 μg/ml Chloramphenicol in einem 14-ml-Rundbodenröhrchen. Inkubiere bei 37 °C mit Schütteln bei 200 U/min für 4 Stunden.
   3. Schalten Sie währenddessen die fluoreszenzaktivierte Zellsortiermaschine (FACS) ein und öffnen Sie die Standard-FACS-Software. Verwenden Sie folgende Einstellungen: Düsenspitzendurchmesser, 70 μm; Empfindlichkeit des Vorwärtsstreubereichs (FSC-A), 300 V-logarithmische Verstärkung; Empfindlichkeit des Seitenstreubereichs (SSC-A), 350 V-logarithmische Verstärkung; Sensitivität des Fluorescein-Isothiocyanat-Bereichs (FITC-A), 450 V-logarithmische Amplifikation; Schwellenwert, FSC-A-Wert 5.
      ANMERKUNG: Typische Einstellungen sind für das FACS-Gerät im Materialverzeichnis angegeben. Passe die Einstellungen für andere FACS-Geräte an.
   4. Verdünnen Sie die metagenomischen Bibliothekszellen aus Schritt 2.2, indem Sie 5 μl der Probe zu einem 5-ml-Rundbodenröhrchen mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) geben.
   5. Platzieren Sie die verdünnte Bibliotheksprobe auf den Ladeport des FACS-Instruments und klicken Sie auf die Schaltfläche "Laden" im Erfassungs-Dashboard der FACS-Software.
   6. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 bis 1.500 Ereignisse/Sekunde ein, indem Sie auf die Flussraten-Schaltflächen im Dashboard klicken und sie steuern.
   7. Erstellen Sie ein log-skaliertes FSC-A- vs. log-skaliertes SSC-A-Streudiagramm auf einem globalen Arbeitsblatt, indem Sie auf den Punktdiagramm-Button in der Werkzeugleiste klicken. Passen Sie das Scatter Gate R1 an, um die Singlet-Ereignisse (Bakterienpopulation) mit dem Polygon-Gate-Button in der Werkzeugleiste einzuschließen.
   8. Zeichnen Sie ein Histogramm mit Zellanzahl vs. log-skaliertem FITC-A auf dem Arbeitsblatt dar, indem Sie auf den Histogramm-Button klicken. Dann stellen Sie die FITC-Spannung im Reiter Zytometereinstellungen im Inspector Control-Fenster so ein, dass der Peak der glockenförmigen Verteilung kleiner als 10,2 von FITC-A ist.
   9. Erstellen Sie ein log-skaliertes FSC-A vs. das FITC-A-Diagramm protokolliert, indem man auf die Schaltfläche "Dot Plot" im globalen Arbeitsblatt klickt. Setzen Sie ein Sortiergatter R2 im Diagramm mit dem Polygon-Gate-Button auf der Symbolleiste, sodass das Gatter zwischen +5 % und -5 % Zellen vom Zentrum der Verteilung entfernt liegt (insgesamt 10 % Zellen um den Gipfel der glockenförmigen Kurve).
   10. Platziere ein Sammelrohr mit 1,2 ml LB mit 50 μg/ml Ampicillin und 12,5 μg/ml Chloramphenicol am Ausgang des FACS-Instruments und sortiere 10⁶ Zellen, die sowohl die R1- als auch die R2-Gatter erfüllen.
   11. Entferne das Sammelrohr, die Kappe und wirbel vorsichtig vor.
        
3. Metagenomisches Enzymscreening
   1. Inkubieren Sie die sortierten Zellen (ab Schritt 2.11) bei 37 °C mit einem Schütteln bei 200 U/min, bis der OD₆₀₀ 0,5 erreicht.
   2. Fügen Sie 1 μl Kopieninduktionslösung hinzu, um die intrazelluläre Fosmid-Kopienzahl zu verstärken. Inkubieren Sie die Zellen weitere 3 Stunden bei 37 °C mit Schütteln bei 250 U/min.
   3. Zur Vorbereitung der Zellen auf die Sortierung geben Sie 0,5 ml der kultivierten Zellen und ein geeignetes Substrat (p-Nitrophenylacetat, p-Nitrophenyl-β-D-Cellobiosid oder Phenylphosphat) in ein 14-ml-Rundbodenrohr bei einer Endkonzentration von 100 μM.
      1. Für eine Kontrollprobe geben Sie 0,5 ml der kultivierten Zellen aus Schritt 3.2 in ein 14-ml-Rundbodenrohr. Füge das gleiche Volumen PBS hinzu wie das Substratvolumen in Schritt 3.3.
   4. Inkubieren Sie die beiden Proben bei 37 °C und schütteln Sie sie bei 200 U/min für 3 Stunden.
   5. Bereite die FACS-Maschine in der Zwischenzeit mit denselben Konfigurationen wie Step 2.3 vor.
   6. Fügen Sie 5 μl der Zellen (zur Sortierung) und Kontrollzellen zu zwei 5-ml-Rundbodenröhren mit jeweils 1 ml PBS hinzu.
   7. Platzieren Sie das Rohr mit den Steuerzellen auf den Ladeanschluss des FACS und klicken Sie auf den Lade-Button im Acquisition Dashboard der FACS-Software. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Ereignisse/Sekunde ein, indem Sie die Flussraten-Buttons auf dem Dashboard steuern.
   8. Erstellen Sie ein log-skaliertes FSC-A- vs. log-skaliertes SSC-A-Streudiagramm, indem Sie auf die Schaltfläche "Dot Plot" im globalen Arbeitsblatt der Software klicken, und passen Sie das Scatter-Gate R1 an, um die Singlet-Ereignisse (bakterielle Population) mit dem Polygon-Gate-Button in der Symbolleiste einzuschließen.
   9. Erstellen Sie ein log-log-skaliertes FSC-A- vs. log-skaliertes FITC-A-Streudiagramm, indem Sie auf den Punktdiagramm-Button auf dem Arbeitsblatt klicken und mit dem Polygon-Gate-Button in der Werkzeugleiste ein Sortiergatter R2 im Plot setzen, sodass weniger als 0,1 % der negativen Zellen innerhalb des R2-Gattes erkannt werden.
   10. Ersetzen Sie das Kontrollprobenröhrchen durch das Sortierprobenröhrchen und stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 bis 3.000 Ereignisse/Sekunde ein, indem Sie die Flussraten-Tasten auf dem Armaturenbrett steuern.
   11. Platziere ein Sammelrohr mit 0,5 ml LB am Ausgang des FACS-Instruments und sortiere 10^4-Zellen , die sowohl die R1- als auch die R2-Gatter erfüllen.
       ANMERKUNG: Das Sortierkriterium kann zwischen den obersten 0,1 % und 5 % des FITC-A im R2-Gate reichen. In diesem Protokoll wurden die obersten 1 % der Zellen als positive Werte aufgenommen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CopyControl	Epizentrum	CCFOS110	Produktionskit der Fosmid-Bibliothek
CopyControl-Induktionslösung	Epizentrum	CCIS125	Fosmid-Kopieninduktionslösung
EPI300	Epizentrum	EC300110	Elektrokompetente Zelle
pCC1FOS	Epizentrum	CCFOS110	Fosmidvektor
Gen-Pulser Mxcell	Bio-Rad		Elektroporationscuvette und Elektroporationssystem
FACSAria III	Becton Dickinson		Durchflusszytometrie (FACS-Maschine)
AZ100M	Nikon		Mikroskop
Ultraschlank	Maöstrogen		LED-Beleuchtung
50-ml-konische Röhre	BD Falcon
14-ml-Rundbodenrohr	BD Falcon
5-ml-Rundbodenröhre	BD Falcon
p-Nitrophenylphosphat	Sigma-Aldrich	N7653	Substrat
p-Nitrophenyl β-D-Cellobiosid	Sigma-Aldrich	N5759	Substrat
p-Nitrophenylbutyl	Sigma-Aldrich	N9876	Substrat
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Trypton 10 g/L, Hefeextrakt 5 g/L, Natriumchlorid 10 g/L
Super optimale Brühe (BB)	BD Difco	244310	Trypton 20 g/L, Hefeextrakt 5 g/L, Natriumchlorid 0,5 g/L, Magnesiumsulfat 2,4 g/L, Kaliumchlorid 186 mg/L
Superoptimale Brühe mit Katabolit-Repression (SOC)		SOB, 0,4 % Glukose
2x Hefeextrakt-Trypton (2xYT)	BD Difco	244020	Bauchspeicheldrüsenverdauung mit Casein 16 g/L, Hefeextrakt 10 g/L, Hefeextrakt 5 g/L
Zellspeichermedien			2x YT-Brühe, 15 % Glycerol, 2 % Glukose
pGESS(E135K)			Ein DNA-Vektor, der dmpR, egfp-Gene mit ihren entsprechenden Promotoren, RBS und Terminator enthält. Siehe Referenz 5 im Manuskript für weitere Details.
Chloramphenicol	Sigma	C0378
Ampicillin	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Flow Cytometry Software Version 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8 % NaCl, 0,02 % KCl, 0,0144 % Dinatriumphosphat, 0,024 % Monokaliumphosphat, pH 7,4