In vitro Batch-Culture-Modell zur Nachahmung der Colon-Fermentation durch die menschliche Darmmikrobiota

Zusammenfassung

Quelle: Ahmadi, S., et al. Ein In-vitro-Batch-Kulturmodell zur Abschätzung der Auswirkungen interventioneller Regimes auf die menschliche Stuhlmikrobiota. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Modellierung der Darmmikrobieller Fermentation, indem Fäkalproben mit fermentierbaren Ballaststoffen unter anaeroben Bedingungen inkubiert werden, um die Produktion von Metaboliten durch die Darmmikrobiota zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden gemäß den Richtlinien des IRB des Instituts durchgeführt.

VORSICHT: Konsultieren Sie die entsprechenden Materialsicherheitsdatenblätter und befolgen Sie die Anweisungen und Richtlinien für geeignete Biosicherheits-Level 2 (BSL-2)-Schulungen. Befolgen Sie alle Kultivierungsschritte gemäß den Standard-Biosicherheitsregeln und verwenden Sie einen BSL-2-Schrank unter aseptischen Bedingungen. Darüber hinaus können Fäkalproben aus verschiedenen Modellen und menschlichen Probanden ein potenzielles Risiko für die Verbreitung mikrobieller übertragener Krankheiten bergen. Suchen Sie sofort medizinische Hilfe im Falle einer Verletzung oder Infektion auf. Darüber hinaus sollte die Verwendung von menschlichen und tierischen Stuhlproben durch institutionelle ethische Komitees genehmigt werden und den Protokollen für die Verwendung von Proben und Subjektinformationen entsprechen.

1. Vorbereitung von Kulturmedien

1. Vorbereitung des Kulturmediums: Bereite neun Arten von Lagerlösungen vor:
   1. Lösung A (1.000 mL): Lösen Sie 5,4 g Natriumchlorid (NaCl), 2,7 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄), 0,16 g Calciumchloriddihydrat (CaCl₂·2H₂O), 0,12 g Magnesiumchloridhexahydrat (MgCl_{2,6H 2}O), 0,06 g Manganchloridtetrahydrat (MnCl_{2,4H 2}O), 0,06 g kobalthaltiges Chloridhexahydrat (CoCl 2,6H ₂O) und 5,4 g Ammoniumsulfat (NH₄)2SO₄ in deionisiertem Wasser, um ein Gesamtvolumen von 1.000 ml zu erreichen.
   2. Lösung B (1.000 mL): Lösen Sie 2,7 g Kaliumwasserstoffphosphat (K₂HPO₄) in deionisiertem Wasser, um ein Gesamtvolumen von 1000 mL zu erreichen.
   3. Spurenminerallösung (1.000 mL): Lösen Sie 500 mg Dinatriumethylendiamin-Tetraacetat-Dihydrat (Na₂EDTA), 200 mg Eisensulfatheptahydrat (FeSO_{4,7H 2}O), 10 mg Zinksulfatheptahydrat (ZnSO_{4,7H 2}O), 3 mg Mangan(II)chloridtetrahydrat (MnCl_{2,4H 2}O), 30 mg Phosphorsäure (H₃PO₄), 20 mg CoCl₂·6H₂O, 1 mg Kupperchloriddihydrat (CuCl 2,2H₂O), 2 mg Nickel(II)-Chloridhexahydrat (NiCl_{2,6H 2}O) und 3 mg Natriummolybdatdihydrat (Na₂MoO_{4,2H 2}O) in deionisiertem Wasser, um das Gesamtvolumen auf 1.000 mL zu ergeben.
      ANMERKUNG: Diese Lösung ist lichtempfindlich, daher sollte man sie in dunklen/schwarzen oder aluminiumumwickelten Tuben/Flaschen aufbewahren.
   4. Wasserlösliche Vitaminlösung (1.000 ml): Lösen Sie 100 mg Thiaminhydrochlorid (Thiamin-HCl), 100 mg D-Pantothensäure, 100 mg Niacin, 100 mg Pyridoxin, 5 mg P-Aminobenzoesäure und 0,25 mg Vitamin B12 in deionisiertem Wasser auf, um ein Gesamtvolumen von 1.000 ml zu ergeben.
   5. Folat: Biotinlösung (1.000 ml): Lösen Sie 10 mg Folsäure, 2 mg D-Biotin und 100 mg Ammoniumbicarbonat (NH₄HCO₃) in deionisiertem Wasser, um ein Gesamtvolumen von 1.000 ml zu erzeugen.
   6. Riboflavinlösung (1.000 mL): 10 mg Riboflavin in 5 mM HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethanesulfonsäure) (1,19 g/L) Lösung auflösen, um ein Gesamtvolumen von 1.000 ml zu erreichen.
   7. Hemin-Lösung (10 ml): 5.000 mg Hemin in 10 mM Natriumhydroxid (NaOH) (0,4 g/L) Lösung auflösen, um das Gesamtvolumen auf 10 ml zu erreichen.
   8. Kurzkettige Fettsäuremischung (10 ml): Kombinieren Sie 2,5 ml N-Valerat, 2,5 ml Isovalerat, 2,5 ml Isobutyrat und 2,5 ml: DL-α-Methylbutyrat.
      ANMERKUNG: Diese Lösung wird empfohlen, in einer Abzugshaube zu verwenden, um Geruch und Dämpfe zu vermeiden.
   9. Resazurin (1.000 mL): 1 g Resazurin in deionisiertem Wasser auflösen und das Gesamtvolumen auf 1.000 mL ergeben.
2. Medium, das für die in vitro anaerobe Fermentation verwendet wird
   1. Zur Herstellung dieses Mediums mischen Sie 330 mL Lösung A, 330 mL Lösung B, 10 mL Spurenminerallösung, 20 mL wasserlösliche Vitaminlösung, 5 mL Folat: Biotinlösung, 5 mL Riboflavin-Lösung; 2,5 ml Hemin-Lösung, 0,4 ml kurzkettige Fettsäuremischung, 1 ml Resazurin, 0,5 g Hefeextrakt, 4 g Natriumcarbonat (Na₂CO₃), 0,5 g Cystein HCl-H₂O und 0,5 g Trypticase sowie 296,1 ml destilliertes Wasser hinzufügen.
   2. Überprüfen Sie den pH-Wert und stellen Sie sicher, dass er etwa 7,0 beträgt; Wenn nicht, passe den pH-Wert mit 1 N HCl oder 1 N NaOH an. Sterilisieren Sie das Medien, indem Sie das Medium mit einem Flaschenfilter unter der aseptischen Arbeitsstation vakuumieren.
   3. Alternativ mischen Sie alle Komponenten (außer Vitamin- und Heminlösungen) und lassen Sie den Autoklav bei 121 °C für 20 Minuten abkühlen und auf Zimmertemperatur abkühlen. Gleichzeitig werden Vitamin- und Heminlösungen mit 0,22 μm-Membranfiltern gefiltert und vor der Dosierung dem autoklavierten und gekühlten Medium hinzugefügt.

2. Vorbereitung der anaeroben Kammer und benötigter Materialien

1. Bewahren Sie alle für das Fermentationsexperiment benötigten Materialien, Lösungen und Werkzeuge mindestens 48 Stunden vor Beginn des Experiments in der anaeroben Kammer auf, um sicherzustellen, dass jeglicher Sauerstoff, der mit Werkzeugen und löslichem Sauerstoff in Puffern/Lösungen verbunden ist, entfernt wird und alle Materialien an die festgelegten anaeroben Bedingungen akklimatisiert werden.
   ANMERKUNG: Benötigte Materialien im Inneren der anaeroben Kammer (48 Stunden vor Beginn des Experiments): (i) Fermentationsmedium; (ii) anaerobe Lösung (hergestellt gemäß Abschnitt 4.1), (iii) Vortexer, (iv) Waage, (v) Muslin-Käsetücher, (vi) Schere, (vii) Trichter, (viii) 1,5, 2,0, 15, 50 mL Rohre, (ix) Pipettor (2, 20, 200 und 1.000 μL) und kompatible Pipetspitzen, (x) Rohrpipett und Pipeten (5 und 10 mL), (xi) Papiertücher, (xii) Markierungen, (xiii) Röhre steht für verschiedene Röhren, (xiv) Abfallbox, (xv) O2-Anzeige und (xvi) 70%ige Ethanol-Sprühflasche (Desinfektionsmittel).

3. Herstellung von Schläuchen und Fasern

1. Wägen Sie 300 mg Inulin und geben Sie es in ein 50-ml-Rohr um, gefolgt von der aseptischen Zugabe von 26 ml bereits vorbereitetem und gelagertem Fermentationsmedium, das in der anaeroben Kammer gelagert wurde. Bereiten Sie für jeden Stuhlprobentyp und jede Versuchsröhrchen (je nach Anzahl der getesteten Verbindungen) ein leeres Rohr in dreifachem Exemplar vor.
2. Lassen Sie diese Röhrchen etwa 24 Stunden in der anaeroben Kammer, damit die Proben hydratiert werden können, bevor das Gärexperiment beginnt. Stellen Sie sicher, dass die Röhrentemperatur zum Zeitpunkt der Impfung 37 °C beträgt, daher werden die Röhren im Inkubator in die anaerobe Kammer gebracht.

4. Herstellung des Inokulums

1. Anaerobe Verdünnungslösung (mindestens 48 Stunden vor dem Gärungsexperiment): 5 g NaCl, 2 g Glukose und 0,3 g Cystein-HCl in deionisiertem Wasser auflösen und das Gesamtvolumen auf 1.000 ml erreichen. Autoklaven und mindestens 48 Stunden vor der Verwendung in der anaeroben Kammer lagern.
2. Fäkalinokulumpräparation (am Tag des Fermentationsexperiments): Wäge 5 g frische Kotprobe in einem 50 ml konischen Rohr, gib eine anaerobe Verdünnungslösung für ein Endvolumen von 50 mL (1:10 w/v) und wirbel 15 Minuten lang oder bis vollständig homogenisiert. Filtern Sie die homogenisierte Mischung durch 4 Schichten sterilen Käsetuch (autoklaviert) und verwenden Sie sie sofort zur Inokulation in den Tuben mit Medien.
   ANMERKUNG: Die Kotproben einer Gruppe von Probanden können zusammengefasst werden, wenn das experimentelle Ziel darin besteht, die Wirkung einer bestimmten Verbindung oder Zutat auf die insgesamt gesunde versus kranke Stuhlmikrobiota im Allgemeinen zu vergleichen.

5. Fermentation und Probenahme

1. Bereiten Sie Tuben gemäß Abschnitt 4.2 vor und inokulieren Sie Blank-/Kontroll- und Versuchsröhrchen mit 4 ml verdünntem und gefiltertem Fäkalieninokulum. Inkubieren Sie die geimpften Röhren bei 37 °C in der anaeroben Kammer. Schütteln Sie die Schläuche einmal pro Stunde und wenden Sie sie sanft um, um die Fasern und das Inokulum wieder aufzuhängen.
2. Entnehmen Sie Proben so häufig wie nötig, zum Beispiel stündlich bis 0, 3, 6, 9 und 24 Stunden während der Gärung, indem Sie eine 2-mL-Aliquot-Probe aus den jeweiligen Gärröhren in ein 2-mL-Rohr entnehmen.
3. Messen Sie den pH-Wert der Aliquots mit einem Labor-pH-Messgerät (indem die pH-Elektrode direkt in die Probe eingesetzt wird); Zentrifugieren Sie die verbleibende Probe bei 14.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C. Sofort das Supernatant und das Pellet in flüssigem Stickstoff einfrieren und nach dem Schnelleinfrieren das Supernatant für die SCFA-Analyse (Kurzkettenfettsäuren) sowie das Pellet für die Mikrobiomanalyse bei -80 °C aufbewahren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ammoniumbicarbonat	Sigma-Aldrich	217255
Ammoniumsulfat	TGI	C2388	Giftig
Calciumchloriddihydrat	Sigma-Aldrich	C3306	Ärgerlich
Kobaltchloridhexahydrat	Sigma-Aldrich	255599
Kuprinchloriddihydrat	Acros organics	2063450000	Toxisch, Nervig
Cystein-HCl	Sigma-Aldrich	C121800
D-Biotin	Sigma-Aldrich	B4501
D-Pantothensäure	Alfa Aesar	A16609
Dinatriumethylendiamintetraacetat-Dihydrat	Biorad	1610729
DL-α-Methylbutyrat	Sigma-Aldrich	W271918
Eisensulfat-Heptahydrat	Sigma-Aldrich	F8263	Giftig
Folsäure	Alfa Aesar	J62937
Traubenzucker	Sigma-Aldrich	G8270
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039
Hepes	Alfa Aesar	A14777
Isobutyrat	Alfa Aesar	L04038
Isovalerat	Alfa Aesar	A18642
Magnesiumchloridhexahydrat	Sigma-Aldrich	M8266
Manganchlorid-Tetrahydrat	Sigma-Aldrich	221279
Niacin (Nikotinsäure)	Sigma-Aldrich	N4126
Nickel(Ii)chlorid-Hexahydrat	Alfa Aesar	A14366	Giftig
N-valerat	Sigma-Aldrich	240370
P-Aminobenzoensäure	MP China	102569	Toxisch, Nervig
Phosphorsäure	Sigma-Aldrich	P5811
Kaliumdihydrogenphosphat	Sigma-Aldrich	P5504
Kaliumwasserstoffphosphat	Sigma-Aldrich	1551128
Pyridoxin	Alfa Aesar	A12041
Resazurin	Sigma-Aldrich	R7017
Riboflavin	Alfa Aesar	A11764
Natriumcarbonat	Sigma-Aldrich	1613757
Natriumchlorid	Fisher-BioReagenzien	7647-14-5
Natriumhydroxid	Fisher Chemicals	S320
Natriummolybdatdihydrat	Acros organics	206375000
Thiaminhydrochlorid	Acros organics	148991000
Trypticase	BD Biosciences	211921
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V2876
Hefeextrakt	Sigma-Aldrich	70161
Zinksulfat-Heptahydrat	Sigma-Aldrich	Z0251
0,22 μm Membranfilter
AMPure magnetische Reinigungsperlen	Agencourt
Anaerobe Kammer mit Inkubator	Forma anaerobes System, Thermo Scientific, USA
Flaschenfilter	Corning
Seihtuch
pH-Meter
Wirbel	Thermowissenschaftlich