Mikroaerobe Fermentation von Bambushydrolysat durch Klebsiella pneumoniae

Zusammenfassung

Quelle: Wei, D., et al., Produktion von Chemikalien durch Klebsiella pneumoniae mit Bambushydrolysat als Rohstoff. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert die mikrobielle Umwandlung von bambusbasierten Zuckern in 2,3-Butanediol durch die Kultivierung von Klebsiella pneumoniae in einem hydrolysatbasierten Medium unter mikroaeroben und leicht sauren Bedingungen.

Protokoll

1. 2,3-Butanediolproduktion durch Wildtyp K. pneumoniae

1. Verwenden Sie 3 Liter Bambushydrolysat als Lösungsmittel für die Mittelzubereitung.
2. Bereiten Sie ein Gärmedium vor, das 4 g/L Mais-Schnaps, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 6 g/L K₂HPO₄, 3 g/L KH₂PO₄ und 0,2 g/L MgSO₄ enthält. Stellen Sie den pH-Wert des Mediums mit 2,5 M NaOH auf neutral ein. Verwenden Sie einen 5-Liter-Bioreaktor mit 3 Litern autoklaviertem Fermentationsmedium für die Fermentation.
3. Verwenden Sie K. pneumoniae-Zellen , die in einem -80°C Niedrigtemperaturkühlschrank gelagert werden.
4. Für die Samenkultur wird eine 250-ml-Kolbe mit 50 ml Luria-Bertani (LB) Medium über Nacht bei 37 °C bebrütet und bei 200 U/min geschüttelt. Verwenden Sie ein LB-Medium mit 10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt und 10 g/L NaCl. ANMERKUNG: Die Zelldichte der Samenkultur sollte OD 2 (optische Dichte bei 600 nm) erreichen.
5. Inokulieren Sie eine Flasche mit 50 ml der Samenkultur im Bioreaktor. Halten Sie die Kultur bei pH 6,0 und 37 °C. Verwenden Sie eine Luftzusatzrate von 2 L/min und eine Rührgeschwindigkeit von 250 U/min, was eine mikroaerobe Bedingung erzeugt.
6. Sammeln Sie während der Gärung alle 2 Stunden 5 ml Proben und analysieren Sie sie mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie, um die chemischen Konzentrationen in der Brühe zu bestimmen.
7. Überwachen Sie die dem Bioreaktor hinzugefügte Alkali online mittels mikrobiellem Brennstoffzellensystem/Datenerfassung oder MFCS/DA.
   ANMERKUNG: Im Fermentationsprozess entstehen organische Säuren, und NaOH wird hinzugefügt, um den pH-Wert der Kultur stabil zu halten. Das hinzugefügte Volumen der hinzugefügten Alkali entspricht der produzierten Säuremenge. Wenn die alkalizugesetzte Leitung stagniert, ist der Prozess abgeschlossen, entweder aufgrund von Kohlenstoffquellenerschöpfung oder Zelltod.

2. R-Acetoin-Produktion durch den BudC-Mutanten von K. pneumoniae

1. Bereiten Sie ein Medium für die Acetoinproduktion vor, das 4 g/L Mais-Schnaps, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 3 g/L Natriumacetat, 0,4 g/L KCl und 0,1 g/L MgSO₄ enthält.
2. Verwenden Sie K. pneumoniae-ΔbudC zur R-Acetoin-Produktion. Wiederhole die Schritte 1.4-1.5.
   HINWEIS: budC codiert 2,3-Butanediol-Dehydrogenase. K. pneumoniae-ΔbudC verliert die 2,3-Butanediol-Dehydrogenase-Aktivität und produziert R-Acetoin statt 2,3-Butanediol.
3. Halten Sie die Kultur bei pH 6,0 und 37 °C. Verwenden Sie eine Luftzusatzrate von 4 L/min und eine Rührgeschwindigkeit von 450 U/min, eine aerobe Bedingung.
   ANMERKUNG: Die Sauerstoffzunahme ist höher als die von 2,3-Butanediol.
4. Untersuchen Sie die Proben wie in Schritt 1.6.

3. 2-Ketogluconsäureproduktion durch den BudA-Mutanten von K. pneumoniae

1. Für die Produktion von 2-Ketogluconsäure verwenden Sie dasselbe Medium wie bei der R-Acetoin-Produktion.
2. Verwenden Sie K. pneumoniae-ΔbudA zur Produktion von 2-Ketogluconsäure. Wiederhole die Schritte 1.4-1.5.
   HINWEIS: BudA kodiert α-Acetolaktat-Decarboxylase. K. pneumoniae-ΔbudA verliert die α-Acetolaktat-Decarboxylase-Aktivität und produziert 2-Ketogluconsäure, wobei Glukose als Substrat verwendet wird.
   HINWEIS: Die Synthese von 2-Ketogluconsäure ist ein säureabhängiger, zustandsabhängiger Prozess. Eine zweistufige Fermentation wurde für die Produktion von 2-Ketogluconsäuren entwickelt; In der ersten Phase wird die Saatgutkultur in den Bioreaktor geimpft.
3. Halten Sie die Kultur bei pH 7,0 und 37 °C. Verwenden Sie eine Luftzusatzrate von 4 L/min und eine Rührgeschwindigkeit von 500 U/min.
   ANMERKUNG: Unter diesen Bedingungen wachsen die Zellen sehr schnell (die Zelldichte erreicht OD 7 in etwa 4 Stunden). Anschließend geht die Gärung in die zweite Phase über, in der der pH-Wert der Kultur auf 5,0 sinkt. Es wird keine Säure hinzugefügt; die in der Kultur produzierten organischen Säuren führen natürlich zu einem pH-Abfall. Bei diesen sauren Bedingungen stoppt das Zellwachstum, aber 2-Ketogluconsäure wird synthetisiert und sammelt sich in der Brühe an.
4. Untersuchen Sie die Proben wie in Schritt 1.6. Mit dem Hydrolysat von Bambus als Kohlenstoffquelle zu verwenden.
   ANMERKUNG: Die Glukose im Medium wird in 2-Ketogluconsäure umgewandelt, und die Xylose wird in Xylonsäure umgewandelt. So entsteht eine Mischung aus 2-Ketogluconsäure und Xylonsäure.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Autoklav	SANYO	3780
Bioreaktor	Sartorius Stedim Biotech	Bostat Aplus
Agitator	IKA	RW 20
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographensystem	Shimadzu Corp	20AVP
Bambuspulver	Gekauft aus der Provinz Zhejiang, China		Netzzahl, 50
Cellulase	Du sagst Biochemical, Shandong, China		200 PFU/mL