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1. Metabolitextraktion
- Proben auf nassem Eis auftauen und die Zellen in einem Homogenisator mit vier 30-Sekunden-Stoßen bei 6.000 U/min zerstören, mit 2 Minuten Abkühlzeit auf Trockeneis zwischen den Zyklen.
- Klären Sie die Lysate 15 Minuten lang in einer vorgekühlten, gekühlten Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit (d. h. 18.213 x g bei ≤4 °C).
- Übertragen Sie das Supernatant in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr.
- Mit einer Mikropipette wird ein kleiner Teil der Probe in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen, um den Rest-Peptidgehalt in Schritt 2 zu quantifizieren; Lagern Sie den Rest bei -80 °C.
ANMERKUNG: Das Volumen der reservierten Probe variiert je nach dem in Schritt 2.1 verwendeten Bicinconinsäure-(BCA)-Test. Diese Probe sollte für sofortige Analyse auf nassem Eis gelagert oder bei -80 °C eingefroren werden.
2. Bicinchoninsäure (BCA) Assay
- Führen Sie einen BCA-Assay wie vom Bausatz empfohlenen Kit durch, wobei Proben aus Schritt 1.4 verwendet werden, um die restliche Peptidkonzentration für jede Probe zu bestimmen.
3. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)
- Mischen Sie 75 μL Staphylococcus aureus (S. aureus)- Extrakt mit 75 μL LC-MS-Lösungsmittel B, hergestellt in Schritt 1.4.
- Vortex mischen und bei 13.000 x g für 5 Minuten drehen.
- Geben Sie 100 μL Supernatant in ein Flüssigchromatographie-(LC)-Fläschchen und verschließen Sie es. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Probe eingeschlossen sind.
- Laden Sie die LC-Vials auf den LC-MS-Autosampler und bearbeiten Sie die laufende Liste in der Software "Offline Worklist Editor".
- Füllen Sie die Spalten "Sample Name" (z. B. Wildtyp-1), "Sample Position" (z. B. P1-A1), "Method" (z. B. Formic Acid-Negative Method) und "Data File" (z. B. Wildtyp-1) aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Arbeitsliste speichern". Öffnen Sie die Software "Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation" und geben Sie die zuvor gespeicherte Arbeitsliste ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Start Worklist Run", um die kontinuierliche LC-MS-Messung zu starten.
- Trennen Sie die Proben auf einer Säule, verknüpfen Sie die Säule mit einem Flugzeitspektrometer (TOF) und koppeln Sie das TOF-Spektrometer mit dem LC-System. Verwenden Sie einen mobilen Phasengradienten wie folgt: 0-2 Min, 85 % Lösungsmittel B; 3–5 Minuten, 80 % Lösungsmittel B; 6–7 Min, 75 % Lösungsmittel B; 8–9 Min, 70 % Lösungsmittel B; 10–11,1 Min, 50 % Lösungsmittel B; 11,1–14 Min, 20 % Lösungsmittel B; und 14,1–24 Min, 5 % Lösungsmittel B; Ende mit einer 10-minütigen Wiederausgleichsphase bei 85 % Lösungsmittel B und einer Durchflussrate von 0,4 mL Min-1.
- Mit einer isokratischen Pumpe wird eine Referenzmassenlösung in den Lauf eingefügt, um eine gleichzeitige Massenachsenkalibrierung zu ermöglichen.
ANMERKUNG: Dieser Schritt basiert auf dem Standard-TPF-Spektrometerhandbuch.- Verwenden Sie die Mischung aus Essigsäure D4 und Hexakis (1H, 1H, 3H-Tetrafluorpropoxy) Phosphazin als Referenzmasslösung für die Echtzeitkalibrierung. Verwenden Sie die isokratische Pumpe mit einer Durchflussrate von 2,5 mL min-1 für die Infusion.
4. Batch-Korrektur der Ionenzählungen
- Bestimmen Sie jede Probe als Referenzprobe für die Batchkorrektur (z. B. Wildtyp, Replikat 1).
- Berechnen Sie die Summe der Ionenzahlen für alle Metaboliten innerhalb der Referenzprobe. Wiederholen Sie diese Berechnung für alle Proben.
- Teilen Sie die Gesamtionenzahl jeder Probe durch die Gesamtionenzahl der Referenzprobe, um ein Verhältnis zu erhalten.
- Teilen Sie die Ionenzahl für jeden Metaboliten innerhalb einer Probe durch das Proben-/Referenzverhältnis, um eine batch-korrigierte Ionenzahl für jeden Metaboliten zu erhalten.
5. Peptidnormalisierung
- Teilen Sie die batch-korrigierten Ionenzählwerte für jede Probe, die in Schritt 4 gewonnen wurde, durch die mit dem BCA-Test in Schritt 2 bestimmte Peptidkonzentration, um einen normalisierten Wert für jeden Metabolit zu erhalten.
ANMERKUNG: Die normalisierten, batch-Batch-korrigierten Ionenzählungen für jeden Metaboliten, die in Schritt 5.1 erhalten wurden, können direkt zwischen den Stämmen verglichen und einer statistischen Analyse unterzogen werden (z. B. ein Mann-Whitney U-Test). Alternativ kann ein Metabolit, von dem bekannt ist, dass er weder durch die Behandlung noch durch den genetischen Hintergrund unverändert ist, als Normalisator verwendet werden, um Veränderungen durch die Zerlegung der Metaboliten zu erkennen. Die Einbeziehung einer bekannten Menge L-Norvalin oder Glutarsäure in den Extraktionspuffer kann verwendet werden, um den Verlust während der Probenverarbeitung auszugleichen.