Überwachung des bakteriellen Wachstums in unterschiedlichen Medienformulierungen mit einem automatisierten Mikrobioreaktor

Zusammenfassung

Quelle: Hemmerich, J., et al. Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion unter Verwendung automatisierter Mikrobioreaktortechnologie. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video demonstriert den Einsatz eines automatisierten Mikrobioreaktors zur Überwachung des Bakterienwachstums und der Sekretion fluoreszierender Proteine als Reaktion auf unterschiedliche Medienformulierungen. Ein gentechnisch verändertes Bakterium, das ein sekretorisches fluoreszierendes Protein exprimiert, wird unter Antibiotikaselektion kultiviert und in nährstoffvariierte Brunnen impft. Echtzeit-optische Messungen der Zelldichte und Fluoreszenz ermöglichen eine vergleichende Analyse der Proteinproduktion unter verschiedenen Wachstumsbedingungen.

Protokoll

1. Vorbereitung von Materialien und Definitionsverfahren
ANMERKUNG: Es wird empfohlen, die experimentellen Methoden auf detaillierter Ebene zu definieren und festzulegen. Diese Standardisierung stellt sicher, dass unterschiedliche Ergebnisse auf intrinsische biologische Variabilität oder unterschiedliche Medienzusammensetzungen zurückzuführen sind. ​
ANMERKUNG: Medienstock-Lösungen: Bereiten Sie individuelle Lagerlösungen für alle untersuchten Medienkomponenten vor. Bereiten Sie hochkonzentrierte Bestände vor, um die Verdünnung verschiedener Volumina für alle Komponenten zu ermöglichen. Das bedeutet, dass nach der Kombination aller Lagerlösungen in ihrem höchsten Volumen gemäß dem Entwurfsplan dies das endgültige Anbauvolumen nicht überschreiten kann, vgl. Absatz "Erstellung der Pipettenliste der mittelgroßen Lagerlösung", Schritt 1.3.3. Wenn die Zugabe einer hochkonzentrierten Lösung zu einem sehr geringen Zufügungsvolumen führt, z. B. < 1/100 des endgültigen Anbauvolumens, wird die Stocklösung entsprechend verdünnt. So wurde in dieser Studie beispielsweise ein Pipettvolumen von weniger als 10 μL als nicht praktikabel definiert. Typischerweise sind Spurenelementlösungen bis zu 1.000-fach im Vergleich zur endgültigen Standardkonzentration im Medium konzentriert. Es ist vorteilhaft, die Medienkomponenten als Vielfache (X-fach) in Bezug auf die Konzentrationen im Referenzrezept zu konzentrieren. Dadurch werden unzulässige Pipettierungsvolumina mit Bruchdezimalzahlen vermieden. Detaillierte Rezepte für alle Standardlösungen des CgXII-Mediums sind im Zusatzdokument enthalten.

1. Funktionierende Zellbank (WCB)
Hinweis: Für jedes Wachstumsexperiment wird ein WCB-Aliquot verwendet. Wenn weitere Aliquots benötigt werden, verwenden Sie 100 ml Brain Heart Infusion (BHI)-Medium in 1.000 ml-Bafflett-Shake-Fächern oder inokulieren Sie mehrere Shake-Kolben, die vor der Zugabe der Glycerollösung zusammengelegt werden.

1. Bereite einzelne Kolonien des rekombinanten Expressionsstamms C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43 auf Agarplatten vor (37 g/L BHI-Pulver, 20 g/L Agar, 25 mg/L Kanamycin). Plattenmaterial kann entweder aus frischer Transformation oder aus einem kryokonservierten Aliquot stammen. Inkubieren bei 30 °C bis zum Erscheinen einzelner Kolonien; Das dauert in der Regel ein bis zwei Tage.
2. Inokulieren Sie eine Shakerkolbenkultur (50 ml BHI-Medium mit 25 mg/L Kanamycin, 500 mL Baffled Flask, 250 rpm, 25 mm Schütteldurchmesser, 30 °C) mit Koloniematerial und inkubieren Sie über Nacht (ca. 16 H).
3. Kombinieren Sie ein Volumen der resultierenden Zellsuspension mit einem Volumen 500 g/L steriler Glycerollösung und verteilen Sie in 2 mL Aliquoten in sterilen Kryokonservierungsfläschchen. Bei -80 °C lagern.

2. MBR-Kultivierungsprotokoll
Anmerkung: Für das in dieser Studie verwendete BioLector MBR-System sind gestreutes Licht (Biomasse) und GFP-Fluoreszenz Intensitätsmessungen, die einen bestimmten Verstärkungswert benötigen. Je höher die Verstärkung, desto stärker wird das optische Signal verstärkt; Deshalb werden auch gestreutes Licht und Fluoreszenz in beliebigen Einheiten (A.U.) gemessen. Bestimmen Sie geeignete Gewinnwerte für Biomasse- und GFP-Detektion in Vorversuchen sowie geeignete Schüttelhäufigkeit und Füllvolumen, um Sauerstoffbeschränkungen bei höheren Biomassekonzentrationen in späteren Prozessphasen zu vermeiden. Die verwendeten Anbaubedingungen ("Flowerplates", also blütenförmige 48-Brunnen-MTPs, Schüttfrequenz von 1.200 U/min, Füllvolumen von 1.000 μL, 10 g/L Glukose als Hauptkohlenstoffquelle) sicherten sauerstoffunbegrenzte Anbauten. Für maximale Sauerstoffübertragungsraten, die durch andere Kombinationen von Füllvolumen und Schütterfrequenzen in blütenförmigen 48-Well-MTPs entstehen, sind Datenblätter des Zulieferers verfügbar. Außerdem können Wachstumsdefekte einzelner Kulturen aufgrund geringer Mengen sekundärer Substrate (z. B. Stickstoff, Spurenelemente) auftreten. Überprüfen Sie daher die Biomassekonzentrationen am Ende des Anbaus. In dieser Studie wurden keine solchen Wachstumseffekte beobachtet.

1. Definieren Sie das Kultivierungsprotokoll für das MBR-System ("BioLector") wie folgt:
2. Filtersatz 1: Biomasse, Gewinn 14. Filterset 2: pH, Gain ist voreingestellt. Filterset 3: pO2, Gain ist voreingestellt. 4: GFP, Gewinn 80.
3. Schüttelfrequenz: 1.200 U/min.
4. Temperatur: 30 °C.
5. Zykluszeit: 15 Min.
6. Experimentzeit: manuell (Kultivierung wird nicht automatisch gestoppt).

3. Erstellung einer mittelgroßen Lösungs-Pipettierliste
Anmerkung: Fast jedes Flüssigkeitshandhabungsrobotersystem ist in der Lage, Pipettierungsaktionen aus externen Dateien auszulesen. Im Grunde genommen sind die minimalen Informationen, die benötigt werden, das Übertragungsvolumen und die Position der Reagenzquelle sowie das Ziel jedes einzelnen Bereichs, dargestellt durch eine Laborgeräteposition auf dem Roboterdeck und eine bestimmte Höhle innerhalb des Labormaterials. Allerdings müssen unterschiedliche Syntaxen für verschiedene Flüssigkeitshandhabungssysteme berücksichtigt werden. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine Dateistruktur für das in dieser Studie verwendete Pipettsystem.

1. Vier Arten von Bestandslösungen werden in jeden Anbaubrunnen pipettiert:

1. Lagerlösungen von Medienkomponenten, die unterschiedlich sind ("Variationsbestände").
2. Wasser, um die unterschiedlichen kumulativen Volumina der oben genannten Bestände auszugleichen.
3. Eine Standardlösung ("Rest Stock"), die alle festen Komponenten enthält. Diese Lagerlösung kann aus Beständen bestehen, die verschiedene Komponenten enthalten, die z. B. bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert oder mit unterschiedlichen Methoden sterilisiert werden.
4. Inokulum, das als letzte Komponente hinzugefügt und direkt vor der Zugabe auf den Arbeitstisch gelegt werden sollte, um das Absetzen der Zellen zu vermeiden.

2. Berechnen Sie pro Kultivierungsbrunnen die zu übertragenden Volumina für alle Medienkomponenten nach:

Das Volumen, das für bestimmte Variation Stocks hinzugefügt werden soll, liegt vielleicht bei null, also wenn diese spezifische Komponente ausgelassen wird.

3. Alle berechneten Bände Vi auf geeignete Zahlen überarbeiten. Pipettierende Lautstärkeschritte in Volumenschritten sollten nicht zu klein sein. Falls nötig, passen Sie die Konzentrationen von Variationsaktien an. Zum Beispiel wurde das minimale Pipettierungsvolumen hier mit 10 μL definiert, und das minimale Inkrementvolumen mit 5 μL. Im Allgemeinen sollten diese Volumina auf der experimentell bestimmten Präzision und Genauigkeit der verwendeten Flüssigkeitshandhabungsstation basieren.

4. Berechnen Sie das Volumen des Ruhebestands, das die festen Komponenten für alle Bohrlöcher enthält, wie folgt:

wobei das maximale kumulative Volumen von Variationsaktien verwendet wird. Daher werden die erforderlichen Konzentrationen der festen Komponenten im Restbestand wie folgt berechnet:

Bereiten Sie den restlichen Bestand entsprechend vor.

5. Berechnet pro Anbaubrunnen das zu zuführende Wasservolumen wie folgt:

6. Listen Sie pro Kultivierungsbrunnen alle hinzuzufügenden Bände in folgender Reihenfolge auf: V_H2O, V_RestStock, V_i, V_Inok. Formatieren Sie die Pipetterliste entsprechend den Spezifikationen der Flüssigkeitsbehandlungsstation, wie zum Beispiel in Abbildung 1 gezeigt.

2. Saatgutkultur, automatisierte Medienaufbereitung und Beginn der Hauptkultur

1. Erstellen Sie ein Protokoll für den Flüssigkeitshandhabungsroboter. Siehe Abbildung 2 und Abbildung 3 für ein Beispielprotokoll für ein "Janus"-System, implementiert in der entsprechenden "WinPREP"-Software. Das Protokoll sollte folgende Aspekte berücksichtigen:

1. Eine ausreichende Laufzeit mit sterilem Gehäuse vor der Medienvorbereitung einbauen.

2. Führen Sie zunächst eine übermäßige Reinigung und Reinigung aller Pipettierspitzen und Schläuche ein.

3. Geeignete Laborbehälter für Lagerlösungen auswählen. Hier eignen sich tiefe Bohrlochplatten mit 12 Säulen zur Speicherung von Variationsstocks, da alle acht Pipettspitzen parallel in die Brunnenkolonnen eingetaucht werden können. Das beschleunigt die Medienvorbereitung erheblich. Wenn 15 mL oder 50 mL Reagenzrohre als Reservoirs verwendet werden, kann nur eine Pipettspitze gleichzeitig hineintauchen. Für andere Bestände wie Wasser und Restmaterial werden 100-mL-Tröge verwendet, da diese Lagerlösungen insgesamt höhere Volumina benötigen.

4. Für jede Lagerlösung ein ausreichendes Gesamtvolumen bereitzustellen, um Abfallmengen, Höhen-Pipettierverschiebungen usw. auszugleichen.

5. Fügen Sie vor dem Impfungsschritt eine Benutzeranweisung ein und stellen Sie sicher, dass dieser Schritt unmittelbar vor der Saatgutkultur durchgeführt wird.

2. Bereiten Sie alle Lagerlösungen steril vor und lagern Sie bis zur Nutzung in geeigneten Behältern, z. B. sterilen 15 mL und 50 ml Reagenzgläsern.
3. Sterilisieren Sie die Tiefbrunnenplatten für die Lagerung der Lagerlösung auf einem Arbeitstisch, z. B. durch Abwischen mit 70 % Ethanol und anschließend Trocknung in einer laminaren Flusshaube.
4. Beginnen Sie mit der Samenkultur, indem Sie 50 ml BHI-Medium mit 25 mg/L Kanamycin und einem Aliquot aus dem WCB inokulieren. Vor dem MBR-Anbau bereiten Sie frisches, lebenswichtiges Inokulum aus exponentiell wachsenden Saatgutkulturen in ausreichender Menge her.
5. Lege alle notwendigen Laborutensilien auf den Roboter-Arbeitstisch und gieße Brühlösung in die entsprechenden Laborgeräte.
6. Starte den robotergesteuerten Workflow zur Medienvorbereitung, damit der letzte Schritt (Impfung) rechtzeitig mit Beginn der Saatgutkultur erreicht wird. Die Gesamtlaufzeit des robotischen Arbeitsablaufs muss im Voraus bewertet werden. Hier betrug die Gesamtlaufzeit etwa 1,5 Stunden.
7. Probe die Saatgutkultur nach etwa 2 Stunden und dann jede Stunde, um das Wachstum anhand der optischen Dichte (OD₆₀₀) zu überwachen. Nach etwa 5 Stunden erreicht die Kultur 3–4 OD₆₀₀ und wird zur Impfung der Hauptkulturen verwendet.
8. Platzieren Sie die Samenkultur auf den Arbeitstisch des Flüssigkeitshandlers und setzen Sie das Vorbereitungsprotokoll fort. Seal-Kultivierung MTP nach der Impfung.
9. Platzieren Sie das versiegelte Kultivierungs-MTP in das BioLector-Gerät und starten Sie das vordefinierte Kultivierungsprotokoll.
10. Entsorgen Sie die verbleibenden Lagerlösungen, falls erforderlich, gemäß Biosicherheitsvorschriften und säen Sie die Kultur vom robotischen Arbeitstisch. Reinigen Sie das wiederverwendbare Laborzubehör und starten Sie das Dekontaminationsprotokoll für den Flüssigkeitshandler.

Ergebnisse

Abbildung 1: Screenshot aus der Volumenpipettenliste zur Sensitivitätsanalyse. Einträge in der ersten Spalte weisen allen Bänden einer Zeile eine eindeutige Kennung zu; diese Identifizierung ist die MTP-Bohrlochnummer des Zielkultivierungs-...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BioLector	M2P-Labs	G-BL-100
Blumenplatte	M2P-Labs	MTP-48-BOH	Für die Kultivierung im BioLector-Gerät
Dichtfolie	M2P-Labs	F-GP-10	Sterile Versiegelung für Flowplate
MATLAB	Mathematikwerke	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	n/a	Frei verfügbar, MATLAB-Installation erforderlich
Janus-Pipetterroboter	Perkin Elmer	n/a	Beinhaltet die Installation der "WinPrep"-Software
12-Säulen-tiefe Bohrloch-Mikroplatten	E&K Wissenschaftlich	EK-2034	Behälter für mittelgroße Lösungen
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	n/a	n/a	Trägt pEKEx2-Plasmid mit Fusion von GFP-Gen und PhoD-Signalpeptid von B. subtilis als Expressionsinsert. Plasmid verleiht Kanamycinresistenz. Beschrieben und veröffentlicht von Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)