Langzeit-Kryokonservierung cyanobakterieller Stämme mit Glycerol oder Dimethylsulfoxid

Zusammenfassung

Quelle: Lea-Smith, D. J., et al. Entstehung markierter und markerloser Mutanten in Modell-cyanobakteriellen Arten. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert die Kryokonservierung von cyanobakteriellen Stämmen, indem konzentrierte Zellsuspensionen mit Glycerol oder DMSO kombiniert und bei niedrigen Temperaturen gelagert werden, was die langfristige Erhaltung lebensfähiger Kulturen für Photosynthese und genetische Studien ermöglicht.

Protokoll

1. Vorbereitung von Kulturmedien

1. BG11 Medium bereiten
   1. Bereite Lagerlösungen mit 100x BG11, Spurenelementen und Eisenmaterial vor (Tabelle 1).
   2. Bereite separate Lösungen von Phosphatbestand, Natriumcarbonat (Na₂CO₃), Stock, N-[Tris(hydroxymethyl)methyl] -2-Aminoethanesulfonsäure (TES)-Puffer und Natriumbicarbonat (NaHCO₃) (Tabelle 1) vor.
   3. Autoklaven das Phosphat und_{Na-2CO3-Lager}. Filter-sterilisierender TES-Puffer und NaHCO₃ mit 0,2 μm-Filtern.
   4. Bereiten Sie BG11 zu, indem Sie 976 ml Wasser, 10 ml 100x BG11, 1 ml Spurenelemente und 1 ml Eisenmaterial kombinieren und die Lösung autoklavieren. Nachdem diese Lösung auf Zimmertemperatur abgekühlt ist, fügen Sie 1 ml Phosphatfond, 1 ml Na₂CO₃ und 10 ml NaHCO₃ hinzu.
   5. Für das BG11 Festmedium geben Sie 15 g Agar und 700 ml Wasser in eine Flasche. Zum zweiten Kolben geben Sie 3 g Natriumthiosulfat (Na₂S₂O₃), 226 ml Wasser, 10 ml 100x BG11, 1 ml Spurenelemente und 1 ml Eisenbrühe. Autoklaven, beide Lösungen. Nachdem diese Lösungen auf Raumtemperatur abgekühlt sind, mischen Sie sie und fügen Sie 1 ml Phosphatbestand, 1 ml Na_2CO3-Lager, 10 ml TES-Puffer und 10 ml NaHCO₃ hinzu.
      ANMERKUNG: Lösungen werden separat hergestellt, um die Niederschlagung bestimmter Salze zu vermeiden.
2. Zur Auswahl von Saccharose bereiten Sie eine 50%ige (mit /v) Saccharoselösung vor. Filtere die Lösung mit 0,2 μm-Filtern und gib BG11 (100 ml 50 % Saccharose bis 900 ml BG11) zu, um BG11/5 % Saccharoseplatten zu erzeugen.
   ANMERKUNG: Gib kein NaHCO₃ zu BG11/5%-Saccharose-Agarplatten hinzu. Füge_wiegewohnt Na2_CO3 hinzu.
3. Für die Kultivierung von Synechococcus werden 10 ml 1 M 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-Ethanesulfonsäure, N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N′-(2-Ethanesulfonsäure) (HEPES) und 1 ml Vitamin B12 (Tabelle 1) zu 1 L BG11-Medium hinzugefügt.
   ANMERKUNG: Die Transformation von Stämmen, die in kommerziell erhältlichen BG11-Medien kultiviert werden, ist deutlich weniger effizient als in den hier beschriebenen BG11-Medienrezepten und wird daher nicht empfohlen.

2. Langzeitlagerung von Stämmen

1. Stellen Sie eine frische Kultur des Stamms auf, indem Sie eine Zellschleife in 30–50 ml BG11-Medium inokulieren. Wachsen Sie die Kultur 3-4 Tage auf OD_{750 nm} = 0,4 bis 0,7.
2. Wasche die Zellen einmal mit BG11 und suspendiere sie in ~2 ml BG11 erneut.
3. Gib 0,8 ml konzentrierte Zellen in ein Röhrchen. Dann fügen Sie 0,2 ml 80% filtersterilisiertes Glycerol hinzu.
4. Optional: 0,93 ml konzentrierte Zellen in ein anderes Rohr geben. Gib 0,07 ml DMSO in dieses Rohr.
   VORSICHT: DMSO ist toxisch und sollte mit angemessenem Schutz behandelt werden.
5. Lagere beide Röhren bei -80 °C. Um die Stämme wiederzubeleben, entferne den Schlauch und kratze einige Zellen mit einem stumpfen Zahnstocher ohne Antibiotika auf eine Agarplatte ab. Laufe wie gewohnt mit einer sterilen Schleife raus.

Tabelle 1: In dieser Studie verwendete Lösungen

Rezepte für Serienlösung
Chemisch	Betrag (g)
100x BG11 (pro L)
NaNO3	149.6
MgSO4,7H 2O	7.49
CaCl2.2H 2O	3.6
Zitronensäure	0.6
Fügen Sie 1,12 ml 0,25 M Na2EDTA hinzu, pH 8,0
0,25 M Na2EDTA, pH 8,0 (pro 100 ml)
Na2EDTA	9.3
Spurenelemente (pro 100 ml)
H3BO3	0.286
MnCl2,4H 2O	0.181
ZnSO4,7H 2O	0.022
Na2MoO 4,2H 2O	0.039
CuSO4,5H 2O	0.008
Co(NO3)2,6H 2O	0.005
Eisenschaft (pro 100 ml)
Eisen-Ammoniumcitrat	1.11
Phosphatfond (pro 100 ml)
K2HPO4	3.05
Na2CO3 Brühe (pro 100 ml)
Na2CO3	2
TES-Puffer, pH 8,2 (pro 100 ml)
TES	22.9
NaHCO3 Schaft (pro 100 ml)
NaHCO3	8.4
HEPES, pH 8,2 (pro 500 ml)
HEPES	119.15
Vitamin B12 (pro 50 ml)
Cyanocobalamin	0.02
Luria Bertani Media (pro 500 ml)
Luria-Bertani-Brühe	12.5
1 M MgCl2 (pro 100 ml)
MgCl2,6H 2O	20.33
Lösung A (pro 200 ml)
MnCl2,4H 2O	0.395
CaCl2.2H 2O	1.47
2-(N-Morpholino)Ethanesulfonsäurehydrat, 4-Morpholineethanesulfonsäure (MES)	0.4265
Lösung A + Glycerol
10-ml-Lösung A
1,5 ml Glycerol

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NaNO₃	Sigma	S5506
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	C1016
Zitronensäure	Sigma	C0759
Na₂EDTA	Fischer	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	M3634
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
Eisen-Ammoniumcitrat	Sigma	F5879
K₂HPO	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Fischer	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO₃	Fischer	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
Cyanocobalamin	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
Bacto-Agar	BD	214010
Saccharose	Fischer	SUC001
Petrischale 90 mm dreifach entlüftet	Greiner	633185
0,2 μm-Filter	Schneidermuskel	16534
100 ml konische Kolben	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38 m	Bemis	FIL003
Phusion High Fidelity DNA-Polymerase	Phusion	F-530
Agarose	Melford	MB1200
DNA-Reinigungskit	MoBio	12100-300
Restriktionsendonukleasen	SCHNABEL
T4-Ligase	Thermowissenschaftlich	EL0011
Luria-Bertani-Brühe	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Kanamycin-Sulfat	Sigma	60615
Ampicillin	Sigma	A9518
GeneJET-Plasmid-Miniprep-Kit	Thermowissenschaftlich	K0503
14 ml Rundbodenröhre	BD Falcon	352059
GoTaq G2 Flexi-DNA-Polymerase	Promega	M7805
425–600 μm Glasperlen	Sigma	G8772
Glycerin	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Leuchtstoffröhren	Gro-Lux	69
HT-Multitron-Photobioreaktor	Infors