Modellierung komplement-vermittelter Phagozytose unter Verwendung von opsonisierten roten Blutkörperchen in vitro

Abstract

Quelle: Nagre, N., et al. Phagozytose und Bakterienbeseitigung der Alveolaren Makrophagen bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt die Bewertung der komplementrezeptorvermittelten Phagozytose mit roten Blutkörperchen von Schafen, die mit IgM und Komplement opsonisiert sind, gefolgt von deren Aufnahme durch Mausmakrophagen. Das Ausmaß der Phagozytose wird quantifiziert, indem ein blaues chromogenes Produkt gemessen wird, das durch hämoglobinkatalysierte Oxidation von Diaminofluoren gebildet wird.

Protocol

1. FcγR- und CR-vermittelte Phagozytose

1. Zur Opsonisierung inkubieren Sie 2 x 10 8 rote Blutkörperchen (SRBC) mit 50 μL Kaninchen-anti-SRBC-IgM oder 50 μL Kaninchen-anti-SRBC-IgG für 30 Minuten bei Zimmertemperatur.
2. Inkubieren Sie IgM-opsonisierte SRBCs mit 50 μL C5-defizienten (C5D) menschlichen Serum für 30 Minuten bei 37 °C, um die Komplementfragmente C3b und C3bi auf IgM-beschichteten SRBCs zu fixieren.
3. Samen Maus-Makrophagenzellen (MH-S-Zellen) (10.000 Zellen/Brunnen) in einer 96-Wellen-Platte und über Nacht inkubieren, um eine ~70%ige Konfluenz zu erreichen. Fügen Sie 100 μL von 1 x 10⁷/mL opsonisierten SRBCs zu jedem Brunnen der MH-S-Zellen hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde bei 37 °C. Waschen Sie ungebundene SRBCs sehr schnell (~1 Min) mit 100 μL Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysepuffer.
4. Lysieren Sie die Zellen mit 0,1 % SDS und fügen Sie 50 μL 2,7-Diaminofluoren (DAF) mit 3 % Wasserstoffperoxid und 6 M Harnstoff hinzu. Messen Sie die Absorption der von Hämoglobin katalysierten Fluorenblau-Bildung bei 620 nm.
5. Bestimmen Sie die Anzahl der SRBCs mit einer Standardkurve mit 620 nm Absorptionswerten und einer bekannten Anzahl von SRBCs. Ähnlich wurden Prozess-MH-S-Zellen mit nicht-opsonisierten SRBCs inkubiert, um sie als Negativkontrollen zu verwenden.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,7-Diaminofluoren (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Molekularbiologie-Abschluss
70 % Ethanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Analytische Note
96-Well-Platte	Corning	3603	Zellbiologie-Qualitätsstufe
ACK-Lysepuffer	Lebenstechnologien	A10492	Molekularbiologie-Abschluss
C5-Mangelserum	Sigma-Aldrich	C1163	Biochemisches Reagenz
Zentrifuge	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Zytozentrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 Ausgabe 11
DMEM Zellkulturmedien	Gibco	11995-065	Zellbiologie-Qualitätsstufe
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Zellbiologie-Qualitätsstufe
Durchflusszytometer	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Pinzette	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Geeignet für die Dissektion von Labortieren
Schüssel mit Glasboden	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Zellbiologie-Qualitätsstufe
Hochdruckspritze	Penn-Century	FMJ-250	Geeignet für den Einsatz von Labortieren
Homogenisator	Omni International	TH-01
Wasserstoffperoxid	Sigma-Aldrich	H1009	Analytische Note
Invertiertes Fluoreszenzmikroskop	Olympus	IX73
MicroSprayer-Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Geeignet für den Einsatz von Labortieren
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Reagensqualität
PBS	Gibco	20012-027	Zellbiologie-Qualitätsstufe
Kaninchen anti-SRBC-IgG	MP Biomedizin	55806	Geeignet für Immunassays
Kaninchen anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Geeignet für Immunassays
Schere	Miltex	5-2	Geeignet für die Dissektion von Labortieren
Schaf-rote Blutkörperchen (SRBCs)	MP Biomedizin	55876	Gewaschene, konservierte SRBCs