Bildgebung der bakteriellen Lokalisierung und Wirtsinteraktion im menschlichen Lungengewebe

Abstract

Quelle: Mills, B., et al., Optische Screening neuartiger bakteriespezifischer Sonden auf ex vivo menschlichem Lungengewebe mittels konfokaler Laserendomikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert die Echtzeitbildgebung fluoreszierend markierter Staphylococcus aureus in Suspension und Lungengewebe mittels faserbasierter konfokaler Fluoreszenzmikroskopie.

Protocol

1. Datenerhebung mit konfokaler Laserendomikroskopie (CLE)
   1. Nach der Einrichtung öffnet sich ein Fenster, um Speicherort und Dateipräfix auszuwählen. Wählen Sie den gewünschten Ordner für die Datenspeicherung aus und benennen Sie das Präfix entsprechend.
   2. Platzieren Sie die Fußpedale so, dass sie vom Bediener leicht zugänglich sind. Linkes Pedal: Laser an/aus; Mittelpedal: Pause; Rechtes Pedal: Aufnehmen/Stopp.
      HINWEIS: Die Lasersteuerung ist ebenfalls über Bildschirmsteuerungen zugänglich.
   3. Klicken Sie auf "Start" auf dem Bildschirm oder drücken Sie das linke Fußpedal, um den Laser einzuschalten. Dadurch beginnt die Aufnahme und erhält Bilder mit 100 % Laserleistung und einer Bildrate von 12 Bildern pro Sekunde (Standardeinstellungen).
      HINWEIS: Für andere Anwendungen können diese Einstellungen bei Bedarf auf dem Bildschirm geändert werden, abhängig vom Beispieltyp.
   4. Fotografieren Sie jede der bakteriellen Suspensionsproben.
      1. Führe das distale Ende der FCFM-Bildfaser (Faserkonfokale Fluoreszenzmikroskopie) ein und führe die Faser langsam durch die Suspension, um die Probe zu untersuchen.
      2. Nehmen Sie Videos beliebiger Länge (bis zu 10 Minuten) auf, indem Sie das rechte Fußpedal drücken oder die Aufnahmesteuerung auf dem Bildschirm auswählen, während sich die Faser langsam um das Sample bewegt.
      3. Reinigen Sie das distale Ende der FCFM-Bildfaser mit 8 % H_2O2 und reinigen Sie zwischen den Proben das Linsenreinigungsgewebe. ​
         HINWEIS: Typische Videolängen von 10 bis 30 Sekunden reichen für In-vitro-Bildgebung aus.
   5. Fotografieren Sie jede der Lungengewebeproben.
      1. Führen Sie das distale Ende der FCFM-Bildfaser in die Probe ein, um direkten Kontakt zwischen dem Ende der Faser und dem Gewebe sicherzustellen. Bewegen Sie vorsichtig das Ende der Bildfaser, um die Probe zu untersuchen.
         HINWEIS: Das Anheben des Endes der Faser vom Gewebe entfernt das Gewebe aus der Brennebene; Dies kann jedoch verwendet werden, um markierte Bakterien abzubilden, die nicht am Gewebe haften.
      2. Nehmen Sie Videos beliebiger Länge (bis zu 10 Minuten) auf, indem Sie das rechte Fußpedal drücken oder die Aufnahmesteuerung auf dem Bildschirm auswählen, während sich die Faser langsam um das Sample bewegt.
         HINWEIS: Typischerweise reichen Videolängen von 30 Sekunden für ex-vivo-Bildgebung am Gewebe aus.
      3. Reinigen Sie das distale Ende der FCFM-Bildfaser mit Linsenreinigungsgewebe und 8 % H2_O2 zwischen den Proben.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-14 Microfuge	SciQuip	90616	Kleine Tisch-Mikrozentrifuge
96-Well-Platte	Corning	3370	Prüfplatte
Calcein AM	Sigma Aldrich	17783	Kommerzieller fluoreszierender Farbstoff
Cellvizio 488 nm Forschungs-CLE	Mauna Kea Technologien	LC-0001-488	Konfokales Endomikroskopie-Lasergerät
Cletop-S	Cletop	14110601	Faserreiniger
Eppendorf (1,5 mL)	Eppendorf	30120086	1,5 mL Mikrofugerohr
Gibcophosphat-gepufferte Kochsalzlösung	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS – Waschmedien
IC-Viewer	Mauna Kea Technologien	LW-0001	Datenerfassungs- und -verarbeitungssoftware für das Forschungssystem CellVizio 488 nm
Nicht-standardisierte Forschung AlveoFlex 488 nm	Mauna Kea Technologien	MP-0002-AF3	Faserkonfokale Fluoreszenzmikroskopiefaser
Quanti Kit 488 nm	Mauna Kea Technologien	LQ-0005	Kalibrierungskit für das CellVizio 488-System
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	Bakterienstamm, der in dieser Studie verwendet wurde
Semimikrospektrophotometrie-Cuvette	Sigma Aldrich	C5416-100EA	Für die Spektrophotometrie
Thermomixer-Komfort	Eppendorf	41102422	Arbeitstischheizung mit Schütteln