Selektive Reinigung von Caenorhabditis-Würmern zur Anreicherung der Darmmikrobiota

Zusammenfassung

Quelle: Morgan, E. et al. Selektive Reinigung wilder Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Isolierung von interessanten Darmbakterien aus wilden Caenorhabditis-Würmern . Die Würmer werden zunächst ausgehungert und gewaschen, um die restlichen Nahrungsbakterien von ihrer Oberfläche und dem Darmlumen zu entfernen und gleichzeitig die Zielmikroben zu erhalten. Nach Oberflächenreinigung und mehreren Kriechschritten werden die Würmer seziert, um Därme mit den interessanten Bakterien zu extrahieren, die dann gesammelt und eingefroren werden.

Protokoll

1. Intestinale Dissektion und PCR-Identifizierung mikrobieller Spezies

1. Tiere 3-4 Tage bei 20 °C züchten, damit sie verhungern können und die Menge an OP50-1 (Escherichia coli-Stamm OP50-1) Bakterien reduzieren. Füge 5 ml M9-Medium auf den Teller der ausgehungerten Würmer hinzu.

2. Mit einer sterilen Glaspipette und einer Zentrifuge wird die M9+-Würmer von der Platte gepipettiert und in ein steriles 15-mL-Zentrifugenrohr übertragen.

3. Mit einer klinischen Zentrifuge wird die Würmer im Rohr bei 1000 x g für 30 Sekunden bei Raumtemperatur gedreht.

4. Mit einer sterilen 15-mL-Pipette wird das Überstandsmittel aus dem Zentrifugenrohr entfernt, ohne die lebenden Würmer am Boden des Rohrs zu stören.

5. Fügen Sie 10 ml M9 + 0,05 % Triton X-100 hinzu und inkubieren Sie das Rohr 20 Minuten auf einem Nutator, um externe Mikroben zu entfernen. Wiederhole das viermal, um die Würmer zu waschen.

6. Nach der letzten Wäsche wird mit einer sterilen Pipettenspitze das Überlagerungsmittel entfernt, ohne das Pellet am Boden in 100 μL der Lösung zu stören.

7. Mit einer sterilen Pipettenspitze wird M9 und die Würmer auf eine unbezaimte NGM-Platte übertragen und die Platte getrocknet, während die Würmer 20 Minuten herumkrabbeln, um OP50-1 aus der Nagelhaut und dem Darm zu entfernen.

8. Geben Sie 250 μL M9 auf die getrocknete Platte und verwenden Sie eine Glaspipette, um M9+-Würmer auf eine neue, ungesaatete NGM-Platte zu übertragen. Lass den Teller wieder trocknen und lass die Würmer 20 Minuten lang herumkrabbeln.

9. Fügen Sie 250 μL M9 zur Platte hinzu und übertragen Sie 100 μL der M9+-Würmer auf ein sauberes Uhrglas.

10. Mit zwei sterilen 26-G-Spritzennadeln enthaupten Sie die Nematoden, indem Sie den Wurm mit einer Nadel festhalten und mit der anderen Nadel den Wurm durchtrennen. Nach der Enthauptung treten der Darm (körnig) und die (transparente) Gonade aus dem Körper natürlich aus.

11. Schneiden Sie ein Stück des freiliegenden Darms ab, indem Sie den Darm mit einer Nadel festhalten und mit der anderen durchschneiden.

HINWEIS: Wenn möglich, überprüfen Sie, dass das betreffende Mikroorganismus noch in versenkten Därmen vorhanden ist, mittels Normarski-Mikroskopie, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) oder Immunhistochemie.

12. Einen einzelnen dissektionierten Darm in ein 0,5 mL PCR-Rohr mit 10 μL sterilem Wasser übertragen. Wiederholen Sie dies für insgesamt mindestens 5 PCR-Röhrchen (Polymerase-Kettenreaktion) mit Darmen verschiedener Tiere.

13. Die PCR-Röhren bei -80 °C für mindestens 5 Minuten einfrieren. Entferne die PCR-Röhrchen aus dem Gefrierschrank und taue die Proben auf.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
10 % Sicherheitsvorsorge	Invitrogen	AM9822
BD PrecisionGlide Nadel – 26 G	Fisher Scientific	305115
KH₂PO₄	Fisher Scientific	P-286
NaCl	Fisher Scientific	S-671
NH₄Cl	Fisher Scientific	A-661
Streptomycin	Millipore-Sigma	S6501-50G
Tetracyclin	Millipore-Sigma	T7660-5G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP-151
Uhrbrille	VWR	470144-850