Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Darmbakterien in Maus-Darmschnitten

Zusammenfassung

Quelle: Ng, K. M., Tropini, C. Visualisierung der Darmmikrobiota-Wirt-Interaktionen mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung, Lektinfärbung und Bildgebung. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video demonstriert das Verfahren der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), um die Darmmikrobiota im Darmgewebe der Maus zu färben, indem fluoreszierende Sonden mit bakterieller rRNA (Ribosomal-Ribonukleinsäure) hybridisiert und die Wirtsstrukturen für mikroskopische Analysen gegenfärben werden.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tierproben betreffen, wurden vom zuständigen ethischen Ausschuss für Tiere überprüft und genehmigt

1. Bakterielle Färbung mit FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung)
   1. Verwenden Sie einen Flüssigkeitsblocker oder einen PAP-Pen (hydrophober Barrierestift), um die Fläche der Flüssigkeitsausdehnung zu begrenzen, indem Sie die Fläche jedes Gewebeschnitts umkreisen. Stellen Sie sicher, dass die Tinte nicht mit dem Abschnitt selbst in Kontakt kommt. Erzeugen Sie einen Kreis so nah wie möglich an jedem Gewebeschnitt, ohne das Gewebe zu berühren, um die Oberfläche zu minimieren, die durch die Hybridisierungslösung bedeckt werden muss.
   2. Vorbereitung der Hybridisierungslösung: Für jeweils 50 μL vorgewärmte Hybridisierungslösung fügen Sie 0,5 μg Sonde hinzu (z. B. 0,5 μL 1 μg/μL Sonde). Pipettieren Sie die Hybridisierungslösung auf die Querschnitte auf dem Objektträger (~20 μL/Schnitt, abhängig von Querschnitts-/Kreisgröße). Schützen Sie die Hybridisierungslösung und die Objektträger ab diesem Punkt während der Inkubationsschritte und Lagerung vor Licht.
   3. Stellen Sie sicher, dass das verwendete Flüssigkeitsvolumen den gesamten Abschnitt bedeckt, wenn Sie mit einem flexiblen Kunststoffabdecker überlagern. Inkubieren Sie den Objektträger in einer feuchten Kammer, um die Verdunstung zu reduzieren. Erstellen Sie eine feuchte Kammer mit einer Pipettenspitzenbox und Tüchern oder Papiertüchern am Boden, die mit überschüssiger Hybridisierungslösung oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) getränkt wurden, um Feuchtigkeit zu erzeugen. Inkubieren Sie die Abschnitte bei 45–50 °C, je nach eingestellter Sonde, für >3 Stunden.
   4. Erwärmen Sie den FISH-Waschpuffer: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl bis 50 °C während der Inkubationszeit. Bereiten Sie genug Waschpuffer vor, um die Objektträger im Coplin-Glas abzudecken.
   5. Entfernen Sie die Kunststoffabdeckungen; Inkubiere die Objektträger in einem FISH-Waschpuffer in einem Coplin-Glas, beide vorgewärmt auf 50°C. Stelle das Coplin-Glas für 10–20 Minuten zurück in den 50°C-Ofen. Für dicke Proben entferne du die Deckblätter aus dem Coplin-Glas, indem du den Puffer hinzufügst und die Deckblätter vorsichtig löst, um ein Verschmieren der Scheibe zu vermeiden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Coplin-Glas	Fisher	08-813E
Deckglas, 22 × 22 mm, Nr. #1	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Resuspendiert auf 5 mg/mL
Leere Pipettenspitzenbox(en)			Zum Schmelzen von Paraffin
FISH-Sonden
FISH-Hybridisierungslösung	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,01 % (w/v) SDS in nukleasefreiem Wasser. Optionale Zugabe von 5–50 % (v/v) Formamid
FISH-Waschpuffer	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl
Fluoreszenzmarkiertes Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) Lektin	Vektorlabore	FL-1061 (Fluorescein-markiert) oder RL-1062-2 (Rhodamin-markiert)	UEA-1 kennzeichnet fukosylierte Glykane, daher ist es nicht für keimfreie Mäuse oder für Proben von Fucosyltransferase-2-(FUT2)-mangelnden Wirten geeignet.
Pinzette
HybriSlip flexible Kunststoffabdeckungen, 22 x 22 mm × 0,25 mm	Sigma Aldrich	GBL722222	Für FISH-Hybridisierungsschritte können Glas-Überdeckungen als Ersatz verwendet werden
ImmEdge hydrophobe Barriere PAP-Stift	Vektorlabore	H-4000
Kimwipes
Mehrzweck-Probenlagerbehälter, 473 mL	Fisher	14-955-117A	Sie können sie durch einen Glas- oder Polyethylenbehälter Ihrer Wahl ersetzen. Methacarn ist nicht mit Polystyrol oder Metall kompatibel.
Nagellack	Elektronenmikroskopiewissenschaften	72180	Jeder Nagellack sollte funktionieren
Ofen			Notwendiger Bereich: 45–60 °C
PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x-Lösung)	Fisher	BP3991	Verdünne auf 1x für das Protokoll
Natriumchlorid	Fisher	S271
Trizma-Hydrochloridlösung, 1M Tris-HCl, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T2663-1L
Wasser, nukleasefrei	Fisher	BP2484100