Ultrazentrifugationsbasierte Isolierung von Legionella-pneumophila-Außenmembranvesikeln

Zusammenfassung

Quelle: Jung, A. L. et al. Legionella pneumophila äußere Membranvesikel: Isolierung und Analyse ihres proinflammatorisken Potenzials bei Makrophagen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert die Isolierung von äußeren Membranvesikeln (OMVs) aus Legionella pneumophila mittels sequentieller Zentrifugation, steriler Filtration und Ultrazentrifugation. Die gereinigten OMVs, angereichert mit Membranproteinen und Lipopolysacchariden, eignen sich für Studien zur Wirts-Pathogen-Interaktion.

Protokoll

1. Legionella pneumophila kultivieren

1. L . pneumophila-Stamm Corby (Wildtyp, WT) auf gepufferten Kohle-Hefeextraktplatten (BCYE) ausbreiten und 3 Tage lang bei 37 °C inkubieren. Inokulieren Sie 10 ml Hefeextraktbrühe (YEB) bei einem OD₆₀₀ von 0,3 mit L. pneumophila von der Präkulturplatte; Inkubieren Sie die Bakterien bei 37 °C auf einem rotierenden Shaker (150 U/min) für 6 Stunden.
2. Überprüfen Sie die Reinheit der Flüssigkeitskultur, indem Sie 100 μL der Suspension auf einer Blutagarplatte verteilen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
3. Gib die restliche Flüssigkeitskultur zu 90 ml frischem YEB-Medium und inkubiere auf einem rotierenden Shaker (37 °C und 150 U/min), um einen OD₆₀₀ von 3,0–3,5 zu erreichen, was etwa 16–20 Stunden dauert.

2. Vorbereitung und Quantifizierung der äußeren Membranvesikel (OMVs) von L. pneumophila

HINWEIS: Führen Sie alle folgenden Zentrifugationsschritte unter sterilen Bedingungen und bei 4 °C durch.

1. Zentrifugiere die Flüssigkeitskultur bei 4.000 x g für 20 Minuten, um die Bakterien zu pelletieren. Überfüllen Sie das Übersetzungsmittel in frische Zentrifugenröhren, entsorgen Sie das bakterielle Pellet und wiederholen Sie die Zentrifugation (4.000 x g für 20 Minuten). Wiederhole diesen Schritt einmal.
2. Steril filtern Sie das verbleibende Supernatant zweimal (Porengröße: 0,22 μm). Übertrage den bakterienfreien Überstandsstoff in Ultrazentrifugenröhren und ultrazentrifugiere mit 100.000 x g für 3 Stunden.
3. Kippe das Supernatant aus und entsorge es. Suspendieren Sie das OMV-Pellet in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Ultrazentrifuge (100.000 x g pro 3 Stunden), um kontaminierende Proteine und LPS zu entfernen.
4. Verwerfen Sie das Supernatant und suspendieren Sie das OMV-Pellet in 500 μL sterilem PBS. Streak 20 μL auf einer Blutagarplatte und auf einer BCYE-Agarplatte, um bakterielle Kontamination der vorbereiteten Vesikel auszuschließen. Inkubieren Sie die Blutagarplatte über Nacht und die BCYE-Agarplatte 3 Tage lang (beide bei 37 °C).
   HINWEIS: Die Konzentration von 100 mL L. pneumophila-Kultur beträgt üblicherweise 1 μg/μL. Lagern Sie die vorbereiteten und quantifizierten OMVs bei -20 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 cm Petrischüssel	Sarstedt AG & Co KG (Nüembrecht, Deutschland)	82.1473
70-Ti-Rotor	Beckman Coulter Corporation (Kalifornien, USA)	337922
Cuvetten	Sarstedt AG & Co KG (Nüembrecht, Deutschland)	67.742
Heracell 240i CO₂-Inkubator	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)	75004515
Inokulationsschleife	Sarstedt AG & Co KG (Nüembrecht, Deutschland)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---
PBS	Biochrom GmbH (Berlin, Deutschland)	L. 1825
Rotierender Schüttler (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Deutschland)	SHKE6000
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, England)	80-2116-30
Steriler Filter (Porengröße: 0,22 μm)	Corning Incorporated (new York, USA)	431096
Aktivkohle	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)	5210.2
Columbia-Agar mit 5 % Schafsblut	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Deutschland)	254005
Hefeextrakt	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland)	2363.2