Isolierung und Kultivierung von Caenorhabditis elegans-assoziierten Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Petersen, C. et al., Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt die Isolierung und Kultivierung von Bakterienarten, die mit Caenorhabditis elegans assoziiert sind. Eine perlenbasierte Lyse von C. elegans, gefolgt von selektiver Kultivierung, ermöglicht die Isolierung verschiedener mikrobieller Stämme für weitere Analysen.

Protokoll

1. Isolierung und Kultivierung von nematodenassoziierten Bakterien (Abbildung 1)

1. Um Bakterien zu isolieren, bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit drei sterilen 1-mm-Perlen, 20 μL M9 Minimal-Medium-Salz (M9) Puffer pro Mulde vor und pipettieren Sie einen einzelnen, gewaschenen Nematoden zu jedem Brunnen, wobei möglichst wenig Flüssigkeit übertragen wird.
   HINWEIS: Alternativ können Wurmpopulationen mit M9-Puffer von den Platten ausgewaschen werden, und ~300 μL wurmhaltiger M9-Puffer können auf 2-mL-Röhren mit 10–15 Perlen übertragen werden.
2. Zerlegen Sie die Nematoden mit einem Perlenhomogenisator (z. B. Perlenschlagen für 3 Minuten bei 30 Hz). Zentrifugieren Sie die Platte oder die Röhrchen kurz, um die Flüssigkeit an den Boden zu bringen (z. B. für 10 Sekunden bei 8000 x g bei Raumtemperatur, RT).
   HINWEIS: Die Anwendung dieser Methode führte zur Isolierung bakterieller Taxa, ähnlich denen, die durch die 16S-Ribosom-DNA-(rDNA)-Amplicon-Sequenzierung aufgedeckt wurden, was darauf hindeutet, dass das beschriebene Perlenschlagen die meisten Bakterienzellen intakt lässt.
3. Sammeln Sie das Supernatant, verdünnen Sie es seriell bei 1:10 und verteilen Sie bis zu 100 μL auf 9 cm große Agarplatten.
   1. Um sicherzustellen, dass die meisten Bakterien kultiviert werden können, verwenden Sie verschiedene alternative Medien mit unterschiedlichen Nährstoffzusammensetzungen, darunter verdünntes Trypticase-Sojaagar (TSA, 1:10-Verdünnung), MacConkey-Agar, Sabouraud-Glukoseagar, Kartoffel-Dextrosenagar oder Hefe-Pepton-Dextrose-Agar.
4. Inkubieren Sie die Platten bei den durchschnittlichen Temperaturbedingungen des Probenahmeortes (z. B. Temperaturen zwischen 15–20 °C für gemäßigte Gebiete) für 24–48 Stunden.
5. Verwenden Sie die Standard-Drei-Streak-Technik und eine sterile Schleife, um reine Bakterienkulturen zu erhalten (Abbildung 1).
   1. Nehmen Sie eine einzelne Kolonie von einer Platte mit einer sterilen Schlaufe oder einem Zahnstocher und streichen Sie sie auf eine neue Agarplatte, die dasselbe Agarmedium enthält, das auch für die Reinigung verwendet wird. Achte darauf, nur etwa ein Drittel der Platte zu verwenden.
   2. Entweder benutze eine neue sterile Schleife oder sterilisiere eine wiederverwendbare Schleife und ziehe sie durch den ersten Streifen, um einen zweiten Streifen auf einem weiteren Drittel derselben Platte zu erzeugen.
   3. Wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie eine sterile Schleife durch die zweite Schleife ziehen.
   4. Inkubieren Sie die Platte unter denselben Wachstumsbedingungen wie für die Isolierung. Diese Technik muss dazu führen, dass einzelne Kolonien im Bereich des dritten Streifens wachsen.
      HINWEIS: Es kann notwendig sein, den Reinigungsschritt mehrfach zu wiederholen, da natürliche Isolate dazu neigen, Biofilme und/oder Aggregate zu bilden.
6. Ziehe die reinen Kolonien in einem flüssigen Medium (vom gleichen Typ wie das Agarmedium) mit derselben Temperatur und Wachstumszeit wie oben (Schritt 1.4)

Ergebnisse

Abbildung 1: Artenidentifikation und Isolierung einzelner Bakterien. Einzelne Nematoden werden mit einem Perlenhomogenisator zerschlagen, und die DNA wird zur Artenbestimmung mittels PCR oder Sequenzierung isoliert. Alternativ wird das zerbrochen...