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Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.
1. Isolierung der intrazellulären bakteriellen Gemeinschaft (IBC): Mundpipettierung von IBCs
HINWEIS: Alle in diesem Abschnitt beschriebenen Methoden wurden einer institutionellen Risikobewertung unterzogen. Das Mundpipettieren birgt das inhärente Risiko, dass die zu übertragende Lösung aufgenommen wird. Dieses Risiko wird weitgehend durch die Nanometervolumen, die dieses Protokoll verwendet, gemindert, und wir empfehlen allen Nutzern des Protokolls, die hier und in der Diskussion aufgeführten Vorsichts- und Praxishinweise zu beachten sind.
- Nachdem die Zellen in das PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) abgekratzt wurden, wird das Mundmikropipettierungsapparat eingerichtet (Abbildung 1C).
- Führen Sie das dickere Ende der ausgezogenen Glaskapillare (das nicht gezogene Ende) in den Gummistopfen (weißes Ende) des Aspiratorrohrs.
- Führen Sie das schmale Ende einer 1-ml-Pipettenspitze in das andere offene (rote) Ende des Aspiratorrohrs ein, um eine enge Passform sicherzustellen.
- Führen Sie das schmale Ende einer 2-ml-Saugpipette in das offene, breitere Ende der 1-ml-Pipettenspitze ein und sorgen Sie erneut für eine enge Passform.
HINWEIS: Das resultierende Setup ermöglicht es dem Forscher, vom breiteren, offenen Ende der Aspiratpipette aus dem Mund zu pipetten, um eine sanfte Saugkraft vom schmalen Ende des Kapillarrohrs am anderen Ende des Geräts zu erzeugen. - Testen Sie das endgültige Mikropipettiergerät mit einer 100-mm-Petrischale mit frischem deionisiertem Wasser. Eine leichte Saugwirkung am offenen Ende der Aspirationspipette (ähnlich wie das Trinken eines Getränks durch einen Strohhalm) sollte den Flüssigkeitsspiegel in der Kapillare erhöhen, aber nicht dazu führen, dass das deionisierte Wasser in das Aspiratorrohr überläuft. Verwenden Sie eine Hand, um das Kapillarrohr zu steuern, und mit der anderen Hand die Position der Petrischale.
HINWEIS: Die Saugstärke, die für das Pipettern eines einzelnen IBC erforderlich ist, variiert von Forschern. Es wird jedoch empfohlen, dass jeder Forscher, der diese Technik versucht, mit einem schwachen Sog beginnt und ihn langsam erhöht, wenn keine Flüssigkeit die Kapillare hinauffließt. Es besteht keine Notwendigkeit für eine Kraft, die größer ist als das Saugen an einem Strohhalm zum Trinken. Wenn die Kapillare während des Tests in Schritt 1.1.4 keine Flüssigkeit aufnimmt, ist es möglich, dass entweder die Kapillare oder der Aspirationsschlauch verstopft sind und ersetzt werden müssen. Es wird außerdem empfohlen, dass alle neuen Forscher zunächst die Kontrolle des Saugs im Mund-Pipettergerät mit sterilisiertem Wasser üben. Außerdem sollte beachtet werden, dass die Kontrolle des vom Mundpipettgerät aufgenommenen Volumens durch die Zunge des Forschers erfolgt. Die Zunge kann die Saugkraft feine anpassen und zudem als Notstopp fungieren. - Nach erfolgreicher Flüssigkeitsaufnahme wird getestet, ob man sie durch vorsichtiges Blasen in das offene Ende der Aspirationspipette aus der Kapillare ausstoßen kann. Stellen Sie sicher, dass beim Ausstoßen der Flüssigkeit keine Blasen entstehen, um eine Kontamination der IBCs während Schritt 1.5 zu verhindern.
HINWEIS: Wie beim Absaugen variiert auch die Stärke des Überdrucks, den der Forscher ausübt, um das IBC in das Zentrifugenrohr auszustoßen, von Wissenschaftler zu Forschern. Es wird empfohlen, dass Forscher, die neu mit diesem Protokoll sind, Schritt 1.1 einige Tage vor der eigentlichen Infektion praktizieren. Ein Vorschlag für das Üben des Mund-Mikropipettierens ist, kleine Mengen sterilisiertes Wasser, gemischt mit einigen Tropfen Lebensmittelfarbe (zur Sichtbarkeit), mit dem Mundmikropipett-Gerät zu übertragen.
- Lege die abgekratzte Zellsuspension unter das Seziermikroskop und identifiziere die IBCs als große fluoreszierende Aggregate (Abbildung 1A, B). Der ideale Vergrößerungsbereich liegt bei 20-40x. Tauchen Sie das feine Ende der Glaskapillare für 1 Sekunden in eine frische PBS-Tube, um die Aufnahme unerwünschtes Volumens durch Kapillarwirkung zu verringern.
- Durch das Mikroskop betrachten Sie das interessante IBC und führen Sie langsam das offene Ende des Kapillarrohrs zum IBC. Verwenden Sie das feine Ende der Glaskapillare, um zusätzliche Zellen in der Nähe jedes IBC wegzufegen, um die Aspiration von zwei oder mehr Zellen zu verhindern oder größere Zellaggregate zu zerlegen.
- Während Sie durch das Mikroskop schauen, üben Sie eine sehr geringe Saugkraft am gegenüberliegenden Ende (Aspirationspipett) des Mund-Mikropipettierungsapparats aus, um das IBC in die Glaskapillare zu führen.
- Nach dem Aufnehmen des IBC werden die Kapillaren in ein leeres 1,5-ml-Zentrifugenrohr gelegt und ein leichter Überdruck ausgeübt, um den Tröpfchen und das IBC in das Zentrifugenrohr zu stoßen (Abbildung 1D).
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3-1.6 mit so vielen IBCs, die aus der aktuellen Blase benötigt werden, bevor Sie zur nächsten Blase übergehen. Wechseln Sie häufig Aspirationspipetten und Kapillaren, um eine Speichelansammlung zu verhindern.
VORSICHT: Bei der Arbeit mit infektiösen (oder klinischen) Bakterienstämmen sollten Sie ständig den Lösungsstand in der Kapillare überwachen. Lassen Sie nicht zu, dass die Menge der pipettierten Flüssigkeit vom Rand der Kapillare in das Aspiratorrohr überläuft. Wenn dies passiert, wechseln Sie sofort zu einem anderen Aspiratorrohr und werfen Sie das vorherige Setup weg. - Wiederholen Sie die Schritte 1.2–1.6 an allen entnommenen Blasen oder bis eine ausreichende Anzahl biologischer Proben für die Versuchsgruppe gesammelt wurde.
- (Optional) Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7, bis alle Versuchsgruppen (oder Mäuse) eingeschläfert und genügend biologische Proben aus jeder Gruppe entnommen wurden.
