Nachweis der Zielgenexpression in einem bakterieninfizierten Maushirn

Zusammenfassung

Quelle: Zhang, S. et al. Intrakranieller subarachnoidaler Infektionsweg zur Untersuchung der Rollen von Streptococcus suis-Biofilmen bei der Meningitis in einem Mausinfektionsmodell. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert die Detektion der Zielgenexpression in einem bakteriell infizierten Mausgehirn. RNA wird extrahiert, mit einem DNA-abbauenden Enzym behandelt und rückwärts in cDNA transkribiert. Die cDNA wird durch thermischen Kreislauf mit genspezifischen Primern amplifiziert, während ein DNA-bindender Farbstoff an die amplifizierte DNA bindet und Fluoreszenz emittiert. Die Fluoreszenzsignale werden analysiert, um das Vorhandensein des Zielgens zu bestätigen.

Protokoll

1. Herstellung von Bakterien

Hinweis: Streptococcus suis (S. suis) serotyp-2-virulente Stamm P1/7 wurde von einem erkranken Schwein mit Meningitis isoliert. Stämm P1/7 wurde in Todd-Hewitt-Brühe (THB, Formel pro Liter THB: Herzinfusion, 3,1 g; Neopepton, 20,0 g; Dextrose, 2,0 g; Natriumchlorid, 2,0 g; Dinatriumphosphat, 0,4 g; Natriumcarbonat, 2,5 g) angebaut und auf Todd-Hewitt-Agar (THA, Formel pro Liter THA: Herzinfusion, 3,1 g; Neopepton, 20,0 g; Dextrose, 2,0 g; Natriumchlorid, 2,0 g; Dinatriumphosphat, 0,4 g; Natriumcarbonat, 2,5 g; Agar, 15,0 g) bei 37 °C und 5 %_CO2.

1. Sammlung von Stämm-P1/7-planktonischen Zellen
   1. Sammeln Sie 5 ml planktonische Zellen aus einer Kultur in der mittleren Logaritamitätsphase (OD₆₀₀=0,6), zentrifugieren Sie 3 Minuten bei 8000 × g und waschen Sie anschließend dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
   2. Die Zellen werden mit 5 ml 25 % Glycerol in THB neu suspendiert, in 5 Röhren gelassen und dann bei -80 °C gelagert.
2. Sammlung von Stamm-P1/7-Biofilm-Zustandszellen
   1. Nehmen Sie 20 ml einer Übernachtkultur und fügen Sie 180 ml frisches THB hinzu; Teilen Sie die verdünnte Kultur gleichmäßig auf 10 runde Kulturplatten auf und setzen Sie die Platten dann in einen Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2_für 24 Stunden.
   2. Nach der Inkubation schütteln Sie die Platte sanft, um die Bakterien, die nicht an der Platte haften, wieder aufzuhängen, und entsorgen Sie dann den Supernatant durch Aspiration.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Platte vorsichtig und vermeiden Sie es, das Sediment wieder aufzuhängen.
   3. Fügen Sie 5 ml PBS hinzu, um Biofilmzellen zu entnehmen, suspendieren Sie das Sediment vollständig wieder und übertragen Sie die Probe dann in ein neues Rohr.
   4. Sonikieren Sie die Biofilm-Zustandszellen aus dem letzten Schritt mit folgenden Parametern: 60 W, 4 Zyklen, 5 s an und 10 s aus.
   5. Zentrifugieren Sie 3 Minuten bei 8000 × g und lagern Sie das Überlagerungsmittel bei -80 °C.
      HINWEIS: Der Supernatant kann Biofilmkomponenten enthalten und kann verwendet werden, um die Biofilmbakterien vor der Infektion wieder aufzuhalten, wie in den Tierversuchen beschrieben (Schritt 2).
   6. Setzen Sie das Sediment mit 10 mL 25 % Glycerol in THB wieder auf und lagern Sie dann die Biofilmzellen bei -80 °C.

2. Tierversuche

1. Verwenden Sie in dieser Studie die 6 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäuse mit SPF. Infizieren Sie alle Mäuse über den intrakraniellen subarachnoidalen Infektionsweg, dessen Injektionsstelle 3,5 mm rostral vom Bregma entfernt liegt.
   1. Für die histopathologische Analyse werden zwei Mäusegruppen (5 Mäuse pro Gruppe) mit planktonischen Zellen oder Biofilm-Zustandszellen in einer Dosis von 3 × 107 koloniebildenden Einheiten (CFU) infiziert, und weitere 5 Mäuse wurden mit PBS als Kontrollgruppe injiziert.
   2. Für den Nachweis der mRNA-Expression von TLR2 und Zytokinen im Gehirn infizieren Sie zwei weitere Mäusegruppen (6 Mäuse pro Gruppe) mit planktonischen Zellen oder Biofilm-Zustandszellen in einer Dosis von 3 × 10⁷ CFU.
   3. Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien, indem Sie serielle Verdünnungen auf THA auftragen.
   4. Eliminieren Sie alle Mäuse 12 Stunden nach der Infektion zur weiteren Forschung. ​
      HINWEIS: Glycerol im Fondmedium muss vor der Infektion entfernt werden. Sowohl planktonische Zellen als auch Biofilm-Zellen, die bei -80 °C gewonnen wurden, werden dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend werden planktonische Zellen mit PBS resuspendiert und auf die passende Dosis für die Infektion verdünnt; Biofilm-Zustandszellen werden mit dem gespeicherten Supernatanten (ab Schritt 1.2.5) neu suspendiert und auf die passende Dosis für die Infektion verdünnt. Das Infektionsvolumen sollte nicht mehr als 50 μL betragen.
2. Nachweis der mRNA-Expression von TLR2 und Zytokinen im Gehirngewebe
   1. Extrahieren Sie die gesamte RNA aus dem Hirngewebe mit einem RNA-Extraktionskit.
      1. Für jede Maus wird das gesamte Gehirngewebe zur RNA-Extraktion verwendet. Teile das gesamte Gehirngewebe in 5 Röhren. Nehmen Sie bis zu 100 mg Hirngewebe und geben Sie 1 ml Lyselösung zu jedem Schlauch, der die vom Set bereitgestellte Lysierungsmatrix enthält.
      2. Verarbeiten Sie das Rohr in einem Homogenisator für 40 Sekunden bei einer Einstellung von 6,0 und zentrifugieren Sie das Rohr dann bei 12.000 × g und 4 °C für 5 Minuten.
      3. Nach der Zentrifugation wird die obere Phase in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen.
      4. Die übertragene Probe 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren; 300 μL Chloroform hinzufügen, 10 Sekunden vortexen, und dann 5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
      5. Zentrifugiere das Rohr bei 12.000 × g und 4 °C für 5 Minuten. Übertragen Sie die obere Phase auf ein neues Rohr.
      6. Fügen Sie 500 μL kaltes absolutes Ethanol in das Rohr ein, bevor Sie es fünfmal umdrehen, und lagern Sie die Probe dann mindestens 1 Stunde bei -20 °C.
      7. Zentrifugiere das Rohr bei 12.000 ×g und 4 °C für 15 Minuten und entferne das Überlagerungsmittel. Waschen Sie das Pellet mit 500 μL kaltem 75 % Ethanol in RNase-freiem Wasser (H₂O).
      8. Entfernen Sie das Ethanol, lassen Sie das Pellet 5 Minuten bei Zimmertemperatur an der Luft trocknen und suspendieren Sie die RNA in 100 μL RNase-freiem H2O.
      9. Inkubieren Sie die RNA 5 Minuten bei Raumtemperatur und bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem RNA-Bioanalysator.
   2. Durchführung der komplementären DNA-(cDNA)-Synthese, einschließlich der Eliminierung der genomischen DNA (gDNA), unter Verwendung eines Thermocyclers mit einem Reverse-Transkriptions-(RT)-Reagenzkit.
      1. Gib 1 μg RNA zu einem Röhrchen mit 2 μL 5x gDNA-Eliminationspuffer, 1 μL gDNA-Eliminationsenzym und RNase-freiem H2O,bis das Volumen 10 μL erreicht. Inkubieren Sie 2 Minuten bei 42 °C.
      2. Gib 10 μL Master-Mix (1 μL RT-Enzym-Mix I, 1 μL RT-Primer-Mix, 4 μL 5x Buffer 2 und 4 μL RNase-freies H2O) zur Reaktionslösung aus dem letzten Schritt und mische dann vorsichtig. Fahren Sie sofort mit der RT-Reaktion fort: 37 °C für 15 Minuten und dann 85 °C für 5 Sekunden.
      3. Führen Sie die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (RT-qPCR) mit einer Echtzeit-PCR-Maschine mit einem SYBR RT-qPCR-Kit durch. Fügen Sie 10 μL 2x Enzym, 0,8 μL Forward Primer, 0,8 μL Reverse Primer, 0,4 μL 50x ROX Reference Dye II, 2 μL cDNA-Vorlage und RNase-freies H₂O bis zu einem Gesamtvolumen von 20 μL hinzu.
      4. Jede Probe wird in dreifacher Ausführung mit folgenden thermischen Parametern durchgeführt: 30 s bei 94 °C, gefolgt von 40 Zyklen mit 5 s bei 95 °C und 34 s bei 60 °C, mit einer Endstufe von 15 s bei 95 °C, 1 min bei 60 °C und 15 s bei 95 °C. Die Primer für RT-qPCR sind in Tabelle 1 aufgeführt. Housekeeping-Gene B2m und 18s rRNA wurden als interne Kontrollmechanismen verwendet.
   3. Berechnen Sie die relative Faltungsänderung basierend auf der ^{2-ΔΔCt-Methode} .

Tabelle 1: Primer für RT-qPCR.

Name des Primers	Sequenz (1,60–1,90 m)	Gensymbol
IL-6 Stürmer	CTTCCATCCAGGTGCCTTCT	IL6
IL-6 Rückwärtsgang	CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG	IL6
TLR2 vorwärts	CACTATCCGGAGGTTGCATATC	Tlr2
TLR2 Rückwärtsfahrt	GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC	Tlr2
CCL2-Stürmer	CTCACCTGCTGCTACTCATTC	Ccl2
CCL2-Rückwärtsgang	ACTACAGCTTCTTTGGGACAC	Ccl2
TNF-α Vorwärts	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT	Tnf
TNF-α Rückwärts	GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG	Tnf
β2m vorwärts	GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT	B2m
β2m rückwärts	TATGTTCGGCTTCCCATTCTC	B2m
18er Vorwärts	GTAACCCGTTGAACCCCATT	18s rRNA
18er Rückwärts	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	18s rRNA

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Todd Hewitt Brühe (THB)	Becton, Dickinson und Co.	DF0492078	Lösen Sie 30 g des Pulvers in 1 Liter gereinigtes Wasser. Autoklaven bei 121° für 15 Minuten.
Agar	DSBIO	16C0050	15 g des Pulvers in 1 L THB auflösen. Autoklaven bei 121° für 15 Minuten.
Milli-Q Referenzwasseraufbereitungssystem	Merck KGaA	Z00QSVCUS	Ohne Dnase/ Rnase
NaCl	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd	10019318
Na₂HPO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009012-01-09
KCl	Xilong Scientific Co., Ltd	9009017-01-09
KH₂PO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009019-01-09
KOH	Xilong Scientific Co., Ltd	9009014-01-09
Glycerol	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	Verdünnt mit gleichem Volumen gereinigtes Wasser, Autoklav bei 121° für 15 Minuten
4 % Paraformaldehyd	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	80096675
25 % Glutaraldehyd	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	30092436	Zehnfach verdünnt mit gereinigtem Wasser zur Fixierung.
Ethanol	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218
Chloroform	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10006818
Spctrophotometer	DeNovix Inc.	DS-11+
Ultraschallzellbrecher	NingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd	JY96-IIN
Zentrifuge	Hitachi Koki Co., Ltd	CT15RE
Kühlschrank	Aucma Co., Ltd	DW-86L500
FastRNA Pro Green Kit	MP Biomedizin	#6045-050
FastPrep-24 Instrument	MP Biomedizin	116005500
Instrument für PCR	SensoQuest GmbH	1124310110
QuantStudio 6 Flex	Thermo Fisher Scientific	4485689
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd	RR820A
PrimeScript RT Reagenz-Kit mit gDNA-Radiergummi	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd	RR047A