Aerosolabgabe von Mycobacterium tuberculosis bei Lungeninfektion in einem Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Mueller, A., et al. Ein experimentelles Modell zur Untersuchung der Tuberkulose-Malaria-Koinfektion bei natürlicher Übertragung von Mycobacterium tuberculosis und Plasmodium berghei. J. Vis. Exp. (2014)

Dieses Video demonstriert die Aerosolabgabe von Mycobacterium tuberculosis (Mtb) an Mäuse mittels eines verneblerbasierten Kammersystems, um eine lungenartige Infektion zu induzieren, und bietet ein kontrolliertes und reproduzierbares Modell zur Untersuchung der luftübertragenen Tuberkuloseübertragung und der Wirts-Pathogen-Interaktionen in vivo.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.

1. Aerosolinfektion von Mäusen mit Mtb unter Verwendung einer Glas-Col-Aerosolkammer

Die beste Methode, die Aerosolinfektion von Versuchstieren mit Mtb (Mycobacterium tuberculosis) zu standardisieren, ist die Verwendung von Mykobakterien aus gefrorenen Beständen mit bekannten CFU-Titern (Koloniebildungseinheiten). Zur Herstellung von Bestandskulturen wird Mtb in Middlebrook 7H9-Brühe kultiviert, ergänzt mit OADC (Oleinsäure, Albumin, Dextrose, Catalase) Anreicherungsmedium und 0,05 % Tween 80, einer Kohlenstoffquelle für Mykobakterien, und gleichzeitig werden Maßnahmen zur Vermeidung bakterieller Klumpungen ergriffen. Kulturen sollten zum Zeitpunkt der Ernte eine OD (optische Dichte) ≤ 1 haben. Bei höherer Überdosis nimmt die Bakterienverklumpung zu und die Lebensfähigkeit nimmt ab. Lagere 1 ml Aliquot bei -80 °C. Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen CFU in gefrorenen Beständen, indem Sie eine Reihe von 10-fachen Verdünnungen von drei unabhängigen Fläschchen auf 7H11-Agarplatten mit 0,5 % Glycerol, 1 g/L Asparagin und OADC anrichten und Kolonien nach 4 Wochen Inkubation bei 37 °C aufzählen. Führen Sie eine Aerosolinfektion wie unten beschrieben durch.

1. Tauen Sie Mtb mit bekanntem CFU-Titer auf und mischen Sie die Federung vorsichtig fünfmal, um Bakterienklumpen mit einer 1-ml-Spritze mit einer 27-G-Nadel zu verteilen. Vermeiden Sie die Produktion von Aerosolen.
2. Je nach gewünschter Infektionsdosis wird das erforderliche Volumen des mykobakteriellen Bestands in ein 50-ml-Rohr mit sterilem phosphatgepuffertem Kochsalzlösungszustand (PBS) übertragen. Das Endvolumen beträgt 6 ml.

HINWEIS: Durch Variation der Anzahl der Mikroorganismen in dieser Suspension wird der Anteil der Bakterien, die Aerosoltropfen tragen, variiert. In der Regel streben wir eine Aufnahme von 100 lebensfähigen Bazillen pro Lunge an (Infektion mit niedriger Dosis). Nach unserer Erfahrung sind dafür etwa 1-2 × 10 à⁶ Mtb/ml in einem Gesamtvolumen von 6 ml erforderlich, davon sind 5,5 ml verneblt. Es wird empfohlen, eine Reihe experimenteller Aerosol-Challenges mit unterschiedlichen Bakterienkonzentrationen durchzuführen, um die idealen Bedingungen für Ihre Infektion zu finden. Während hochdosierte Infektionen mit bis zu 5.000 Mykobakterien den Infektionsprozess beschleunigen können, können nur fünf Bakterien erfolgreich Mäuse per Aerosol infizieren. Die Infektionsrate liegt in der Regel bei 100%.

3. Entfernen Sie ausreichend Volumen (über das endgültig benötigte Volumen hinaus) für die Beschichtung, um den Inokulumtiter zu bestimmen; Wir entfernen normalerweise 500 μl technische Dreifachplatten.
4. Platzieren Sie die Tiere in einen abgedeckten Netzkörb (eine Maus pro Korb) innerhalb der runden Aerosolkammer und schließen Sie den Deckel der Aerosolkammer.

HINWEIS: Andere Modelle sind mit einem kuchenförmigen Korb ausgestattet, der aus fünf einzelnen Fächern besteht, von denen jedes 20 Mäuse aufnehmen kann.

5. Befestigen Sie die Venturi-Verneblereinheit an den drei Edelstahl-Steckschlüsselverbindungen.
6. Entfernen Sie die mykobakterielle Suspension aus dem 50-ml-Röhrchen mit einer 10-ml-Spritze, die mit einer 18-G-Stumpfnadel versehen ist, und führen Sie die Spritze in eine geschlossene Transportbox zur Aerosolkammer.
7. Entfernen Sie den Schraubverschluss der Verneblereinheit und spritzen Sie die Mykobakterien-Suspension vorsichtig in den Vernebler. Vermeiden Sie die Bildung von Aerosolen. Werfen Sie die Spritze in einen scharfen Behälter mit 2 % Buraton. Versiegeln Sie den Vernebler mit dem Schraubverschluss.
8. Schalte den Hauptstromschalter und die UV-Lampe ein. Die Anzeige auf dem Kontrollfeld zeigt "Glas-Col Apparatus Co".
9. Schalte den Programmschalter ein. Die Anzeige zeigt an: "Ist der Vernebler bereit?" "Ist der Korb geladen?" Drücke Enter, wenn bereit." Drücken Sie Enter.
10. Das Display zeigt "Vorheizzeit 900 ein"; Das bedeutet, dass die Vorheizzeit für den Verbrennungsofen (der die Abluft dekontaminiert) 900 Sekunden beträgt. Drücken Sie Enter.
11. Die Anzeige zeigt "Enter Nebulizing time 1.800"; Das bedeutet, dass die Vernebelungszeit standardmäßig auf 1.800 Sekunden gesetzt ist. Um die Vernebelungszeit zu verlängern, geben Sie "2.400" ein und drücken Sie Enter.

HINWEIS: Während des Nebulisierungszyklus atomisiert unter Druck die Luft die Suspension, wodurch kleine Aerosoltropfen mit Mykobakterien entstehen. Mit dem Hauptluftstrom werden diese Tröpfchen (etwa 2–5 μm groß) in die Aerosolkammer geleitet.

 

12. Die Anzeige zeigt "Enter C.D. Time 1.800"; Das bedeutet, dass der Zerfallszyklus 1.800 Sekunden dauert. Stellen Sie auf "2.400" ein und drücken Sie Enter.

HINWEIS: Während dieses Zyklus kann die Wolke, die sich während des Nebulisierungszyklus in der Aerosolkammer angesammelt hat, zerfallen. Die kleinen Tröpfchen werden von den Versuchstieren eingeatmet.

13. Die Anzeige zeigt "Enter Dec Time 900"; Das bedeutet, dass der UV-Licht-Dekontaminationszyklus 900 Sekunden dauert. Drücken Sie Enter. Die Maschine beginnt mit Vorwärmen, Verneblung, Wolkenzerfall und UV-Dekontamination.
    VORSICHT: Der Vakuumdurchflussmesser sollte 60 Kubikfuß/Stunde anzeigen (prüfen, wann der Vorheizzyklus beginnt; gegebenenfalls das Vakuumkontrollventil einstellen) und der Druckluftdurchflussmesser 10 Kubikfuß/Stunde (prüfen, wann der Verneblungszyklus beginnt; entsprechend das Luftregelventil anpassen).
14. Wenn der Zyklus abgeschlossen ist, zeigt das Tastenfeld "Prozess abgeschlossen – Probe entfernen" an. Schalte das Programm, UV und den Hauptschalter aus.
15. Überprüfen Sie, ob die mykobakterielle Suspension vollständig vernebelt wurde, und wenn nicht, erfassen Sie das verbleibende Volumen, indem Sie die Suspension vorsichtig mit einer geeigneten Spritze mit einer 18-G-stumpfen Nadel entfernen. Das verbleibende Volumen sollte nicht mehr als 1 ml betragen.
16. Entfernen Sie den Vernebler aus den Gelenken und legen Sie ihn mindestens 2 Stunden in eine Pfanne mit 2 % Buraton, meist erfolgt die Desinfektion O/N. Anschließend werden Sie den Vernebler in eine frische Pfanne legen und gründlich mit Wasser abspülen. Lass den Vernebler an der Luft trocknen.
17. Öffnen Sie die Aerosolkammer und bringen Sie die Tiere zurück in ihre Käfige. Beutel die Körbe in Autoklavenbeutel und Autoklaven. Wischen Sie die Oberflächen der Innenseite der Aerosolkammer mit 2 % Buraton sauber.

HINWEIS: Aus Sicherheitsgründen sollte während dieses Eingriffs ein elektrischer Luftreiniger getragen werden.

18. Mit den verbleibenden 500 μl der mykobakteriellen Suspension (siehe Schritt 1.3) werden 10-fache Verdünnungen eines technischen Trilikats (3 x 100 μl) auf 7H11-Agarplatten verdünnt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Buraton	Schülke		Wirkstoffe: Aldehyde (Formaldehyd, Glutaraldehyd, Oxalaldehyd, Ethylhexanal)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	Für Mtb-Brühekulturen
Middlebrook 7H11	BD Biosciences	283810	Agar-Medium für die MTB-Kultur
Middlebrook OADC-Anreicherungsmedium	BD Biosciences	212240	Fügen Sie 7H9 und 7H11 für die MTB-Kultur hinzu
Atmungsexpositionssystem	Glas-Col
Nebulisator-Venturi	Glas-Col