Biolumineszenzbildgebung bakterieller Infektionen bei Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: de Vries, C. R., et al., Ein verzögertes Impfungsmodell der chronischen Wundinfektion von Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video demonstriert eine biolumineszente Bildgebungstechnik zur Überwachung des Verlaufs bakterieller Infektionen in einem lebenden Mausmodell. Pathogene Bakterien, die mit dem luxABCDE-Reportersystem konstruiert wurden, senden Licht an der Infektionsstelle aus, was die Visualisierung metabolisch aktiver Bakterien ermöglicht. Durch die Abbildung der Maus über die Zeit können Forscher die Infektionsdynamik nicht-invasiv verfolgen und die biolumineszente Signalintensität quantifizieren.

Protokoll

1. Herstellung und Wachstum von Bakterien

1. Führen Sie alle Arbeiten mit P. aeruginosa und Tieren mit BSL-2-Vorsichtsmaßnahmen gemäß dem institutionellen Biosicherheitsausschuss des Forschers und den Richtlinien des Tiernutzungsausschusses durch. Alle hier beschriebenen Schritte mit P. aeruginosa, einschließlich Mausimpfung, in einem Biosicherheitsschrank ausführen.
2. Der leuchtende PAO1:lux-Stamm von P. aeruginosa ist auf Anfrage in unserem Labor erhältlich. Streak PAO1, als gefrorenes Glycerolfond gelagert, auf Lysogeny Broth (LB) Agar. Für den lumineszenten PAO1:lux-Stamm sollte LB-Agar selektive Antibiotika enthalten (100 μg/mL Carbenicillin und 12,5 μg/mL Kanamycin). Über Nacht bei 37 °C in einem bakteriellen Inkubator wachsen.
3. Wähle eine isolierte Kolonie und ziehe sie über Nacht bei 37 °C in 3 ml LB Medium, pH 7,4. Bei lumineszenten Stämmen sollte die Brühe 100 μg/mL Carbenicillin enthalten. Wachsen Sie unter wackelnden, aeroben Bedingungen.

2. Vorbereitung des Verfahrens

1. Lassen Sie alle chirurgischen Mitarbeiter einen sauberen Kittel/Laborkittel, eine Gesichtsmaske, ein Haarnetz und Handschuhe tragen.
2. Alle chirurgischen Werkzeuge mit Autoklaven, einschließlich Schere und Pinzette. Verwenden Sie aseptische Techniken, um Werkzeuge zwischen Tieren zu sterilisieren.
3. Reinigen Sie den Operationstisch mit Ethanol und bereiten Sie ein sauberes Operationsfeld vor.

3. Haarentfernung

1. Betäuben Sie 8–12 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse mit 1%–3 % Isofluran. Forscher sollten bei der Anwendung von Isofluran die Richtlinien ihres veterinärmedizinischen Personals für die Anästhesie befolgen.
   1. Beginnen Sie mit der Anästhesie, indem Sie 1%–3% Isofluran abgeben und den Sauerstofffluss auf 1,5 L/min anpassen. Stelle die Maus in die Induktionskammer.
   2. Kneif die Zehe der Maus, um die Tiefe der Anästhesie einzuschätzen. Wenn die Maus nicht mehr auf die Stimulation reagiert, wird sie aus der Induktionskammer entfernt und mit ihrer Nase im Isofluran-Nasenkegel auf die Operationsbank gelegt.
   3. Tragen Sie auf beide Augen ein Augenschmiermittel auf.
2. Wiegen Sie die Maus, um ein Ausgangsgewicht vor dem Eingriff zu erhalten.
3. Legen Sie die Maus in eine Bauchlage. Injizieren Sie die Maus subkutan mit vorgewärmtem, sterilem 0,9 % Natriumchlorid, 250 μL an jeder Flanke, insgesamt 500 μL.
4. Rasieren Sie den Rückenbereich der Maus mit einem elektrischen Rasierer. Das Rasieren sollte an einem anderen Ort als der Operationsstation erfolgen, um eine Kontamination der Wunde zu verhindern.
5. Tragen Sie eine dünne Schicht Haarentfernungslotion auf. Lassen Sie die Lotion 20–60 Sekunden einwirken. Entferne die Haare und die überschüssige Lotion mit Gaze, die in warmem Wasser angefeuchtet wurde. Nach der Haarentfernung beginnen Sie mit dem Exzisions-Wounding-Verfahren.

4. Exzisions-Wundchirurgie mit voller Dicke

1. Injektion von Buprenorphin mit langer Freisetzung 0,6–1 mg/kg subkutan mittels einer 25-G-Nadel im mittleren dorsalen Bereich der Maus. Langsam freisetzendes Buprenorphin lindert Schmerzen über 48–72 Stunden.
2. Desinfizieren Sie die Operationsstelle. Wischen Sie die Rückenseite mit einem sterilen Betadin-Abstrich ab. Wischen Sie überschüssiges Betadine mit einem sterilen Alkoholabstrich ab. Dies sollte dreimal durchgeführt werden (abwechselnd zwischen Betadin und Alkohol), wobei das Abstrich von der Mitte in kreisförmiger Richtung zum Rand geführt wird. Lass den Bereich an der Luft trocknen.
3. Lege einen Vorhang um die Operationsstelle mit steriler Mullbinde oder Frischhaltefolie.
4. Die Haut vorsichtig straff dehnen. Verwenden Sie eine sterile 6 mm durchmessige Hautbiopsie, um einen ersten Schnitt durch die linke dorsale Epidermis zu machen. Wiederholen Sie sich auf der rechten dorsalen Haut.
5. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut von der Mitte des linken umrandeten Wundbereichs aus zu festhalten. Entfernen Sie die Epidermis- und Hautschicht mit einer Schere. Wiederholen Sie das auf der rechts umrandeten Wundstelle, um symmetrische Exzisionswunden zu erzeugen.
6. Waschen Sie Wunden mit 50 μL steriler Kochsalzlösung. Lassen Sie die Operationsstelle und die umliegende Haut an der Luft trocknen. Dann decken Sie die Wunden und den Rücken mit einem transparenten Folienverband ab.
7. Setze die Maus zurück in einen sauberen Käfig. Haus 1 Tier pro Käfig.
8. Stelle den Käfig auf ein Heizkissen und einen Monitor, bis die Maus aufwacht.
9. Wenn Sie die oben genannte Operation an mehreren Tieren durchführen, verwenden Sie einen Heißperlensterilisator, um alle chirurgischen Instrumente zwischen den Tieren zu reinigen.
10. Planen Sie 24 Stunden ein, damit die Mäuse sich von der Operation erholen und eine provisorische Wundmatrix über den Wunden bilden, bevor mit der Inokulation mit Bakterien fortgeht.

5. Impfung mit P. aeruginosa

1. Verdünnen Sie die PAO1:lux-Kultur über Nacht auf OD600 = 0,05 in 75 mL LB-Medien, das 100 μg/mL Carbenicillin enthält, und lassen Sie die Bakterien wachsen, bis die Kultur sich in der frühen exponentiellen Phase befindet (OD₆₀₀ ≈ 0,3). Dies sollte etwa 2–3 Stunden dauern.
2. Verdünne PAO1: Lux in PBS auf eine Konzentration von (7,5 ± 2,5) x 10² CFU/mL. Stellen Sie sicher, dass Sie überschüssiges Inokulum vorbereiten, um genügend Volumen zu gewährleisten und nach dem Experiment eine Anplatte zu ermöglichen. Beim Transport zwischen Einrichtungen (z. B. vom Labor zum Vivarium) verwenden Sie eine doppelte Eindämmung in einer undicht gekennzeichneten Biohazard-Box.
3. Führen Sie alle Arbeiten mit P. aeruginosa und Mäusen unter Verwendung von zugelassener persönlicher Schutzausrüstung in einem von der Tierbiosicherheit Level 2 (ABSL-2) zugelassenen biologischen Sicherheitsschrank (BSC) durch. Wiederverwendbare Geräte, wie die Waage, sollten mit Frischhaltefolie bedeckt werden, um Verunreinigungen zu verhindern.
4. Betäuben Sie mit 3 % Isofluran, wie oben beschrieben. Wige die Maus und notiere das Gewicht. Injizieren Sie die Maus subkutan mit vorgewärmtem, sterilem 0,9 % Natriumchlorid, 250 μL an jeder Flanke, insgesamt 500 μL.
5. Wenn der transparente Folienverband der Maus über Nacht abgelöst wurde, entfernen Sie vorsichtig eventuelle Krusten und legen Sie einen neuen Verband auf.
6. Verwenden Sie eine 500 μL Tuberkulin-27-G-Sicherheitskappenspritze, um 40 μL der PAO1:lux-Suspension durch den transparenten Filmverband in jede Wunde einzubringen. Für nicht-impfende/PBS-Wundkontrollen sollten verschiedene Mäuse verwendet werden, um eine Kreuzkontamination von der kontralateralen Seite zu verhindern.
7. Setze die Maus zurück in ihren Käfig auf ein Heizkissen und Monitor, bis sie aufwacht. Alle Mäuse sollten einzeln in separaten Käfigen untergebracht werden, um Kreuzkontamination zu verhindern.
8. Stellen Sie eine kalorienreiche Nahrungsergänzungspaste zwischen Futterpellets auf dem Boden des Käfigs bereit.
9. Verwenden Sie das restliche Inokulum, um eine LB-Agarplatte zu streichen. Zähle die Kolonien, um die Anzahl der verabreichten Bakterien zu bestätigen.

6. In vivo Bildgebung infizierter Wunden

1. Befolgen Sie die BSL-2-Eindämmungsprotokolle für den Transport von Mäusen zum und vom Bildgebungsinstrument, einschließlich der Verwendung eines sekundären Behälters. Seien Sie vorsichtig, während des Transfers der Maus in die Induktionskammer oder das Bildgebungsinstrument keine Tiereinstreu zu übertragen oder fallen zu lassen.
2. Induktionen von Anästhesie der Maus mit eingeatmetem 1 % – 3 % Isofluran in einer Induktionskammer.
3. Sobald die Maus betäubt ist, wird sie in Bauchlage in der Bildaufnahmekammer eines optischen Bildgebungssystems mit der Nase im Isofluran-Nasenkegel gelegt.
4. Öffnen Sie das Softwareprogramm.
5. Die Erfassungsparameter variieren je nach Anzahl der gleichzeitig abgebildeten Tiere und der Intensität der Biolumineszenz. Die grundlegenden Parameter umfassen Belichtungszeit, Binning, Blendblende und Sichtfeld (FOV). Unsere Standardstarteinstellungen sind 30 Sekunden, Binning Low (2), Blendblende 1,2 und FOV 25. Passe diese Einstellungen je nach Bedarf an, je nach Bedarf des Forschers.
6. Analysieren Sie Lumineszenzdaten mit einem Bildgeberprogramm. Lumineszenz wird als Pseudofarbbild dargestellt, das auf ein Farbfoto der Mäuse gelegt wird.
   1. Erstellen Sie an der Wundstelle ein Interessengebiet (ROI) und messen Sie den durchschnittlichen Fluss (Photonen/Sekunde) im Griff. Beachten Sie, dass Daten auch als Strahlung angegeben werden können (Photonen/Sekunde/cm²/Steradian), aber solange der Abstand der Bildgebungsplattform zur Kamera zwischen den Bildgebungen konstant bleibt, ist der Fluss ausreichend.
   2. Messen Sie den Hintergrund, indem Sie an einem zufälligen Bereich auf der Bildgebungsplattform einen ROI erstellen. Subtrahiere die Hintergrundanzahl der Photonen pro Sekunde.
   3. Exportiere die Daten in eine Tabelle zur weiteren Analyse.
7. Führen Sie die oben beschriebenen Bildgebungen so oft wie täglich durch, um den Verlauf der Infektion zu verfolgen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,9 % Natriumchlorid-Injektion	Hospira	2484457
18 G x 1 sterile Nadel	BD	305195
25 G x 1 1/5 sterile Nadel	BD	305127
Alkoholabstrich	BD	326895
Aura Imaging Software	Bildgebung von spektralen Instrumenten	n/a
Betadine	Purdue Frederick Company	19-065534
Buprenorphin SR LAB	Zoopharm	n/a
C57BL/6J männliche Mäuse	Das Jackson-Labor	664
Einwegbiopsie-Punch, 6 mm	Integra	33-36
Feine Schere – Wolframkarbid	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	14568-09
Glasperlen-Trockensterilisator	Harvard-Apparat	61-0183
Granulierter Agar	Fisher-BioReagenzien	BP9744
Heizpolster	Milliard	804879481218
Insulinspritze mit 28-G-Nadel	BD	329461
Lago X Bildgebungssystem	Bildgebung von spektralen Instrumenten	n/a
LB-Brühe	Fisher-BioReagenzien	BP1426
Leur-Lok 1 mL Spritze	BD	309628
Mini Arco Tiertrimmer	Wahl Professional	919152
Nair Haarentfernungslotion mit Babyöl	Kirche und Dwight	n/a	Erhältlich in jeder Apotheke
Oktagon-Zange	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	11041-08
Petrischale	Falke	351029
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1x	Corning	21-040-CV
Press- und Versiegelungsfolie	Gut	n/a
SafetyGlide Insulinspritze mit 30-G-Nadel	BD	305934
Safetyglide Insulinspritze, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW	BD	305934
Maßstab	Ohaus Scout Pro	SP202
Supplementales Nahrungsergänzungsmittel	Henry Schein Tiergesundheit	29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm	3M	1624W