Co-Infiltrationstest zur Untersuchung von Erregereffektoren, die die Abschaltung von Pflanzen-RNA unterdrücken

Zusammenfassung

Quelle: Shi, J. et al. Screening und Identifizierung von RNA-Silencing-Suppressoren aus sekretierten Effektoren pflanzlicher Krankheitserreger. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video demonstriert einen Co-Infiltrationstest zur Identifizierung von Pathogen-Effektorproteinen, die die RNA-Silencing in Nicotiana benthamiana 16c unterdrücken. Ein fluoreszierender Reporter und ein Kandidat-Effektorgen werden über Agrobacterium in Pflanzenblätter abgegeben. Normalerweise degradiert RNA-Silencing die Reporter-Transkripte und reduziert die Fluoreszenz. Suppressoreffektoren blockieren diese Reaktion und erhalten so die Fluoreszenz. Dieser Test bietet eine schnelle, visuelle Methode, um mikrobielle Effektoren zu screenen, die die Wirtsverteidigung stören.

Protokoll

Ko-Infiltration Nicotiana benthamiana blättert

1. Mische gleiche Mengen einer Agrobacterium-Kultur mit 35S-GFP mit einer Agrobacterium-Kultur mit 35S-Gurkenmosaikvirussuppressor 2b (CMV2b), mutmaßlichem Effektor oder leerem Vektor (EV).
2. Infiltrieren Sie vorsichtig und langsam die gemischten Agrobacterium-Suspensionen an den abaxialen Seiten von N. benthamiana 16c-Blättern mit einer 1-ml-Nadellosspritze.
3. Entfernen Sie die verbleibende bakterielle Suspension von den Blättern mit Weichgewebewischern und umrunden Sie die Ränder der infiltrierten Flecken mit einem Maker-Pen.
4. Lassen Sie die infiltrierten Pflanzen in der Wachstumskammer unter denselben Wachstumsbedingungen.
   
   HINWEIS: Aus Sicherheits- und Gesundheitsgründen sollten während der Infiltration Schutzbrillen und eine Maske getragen werden. Um Kreuzkontamination zu verhindern, sollten die Handschuhe zwischen den Infiltrationen gewechselt oder mit Ethanol sterilisiert werden. Normalerweise werden für die Infiltration mindestens 1 ml Agrobacterium-Suspensionen pro Blatt benötigt. Für die systemische Stilllegung werden mindestens zwei Blätter für die Infiltration benötigt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
UV-Lampe	Analytik Jena	UVP B-100AP	Beobachtung