Isolierung von Bakterien aus dem Mücken-Mitteldarm

Zusammenfassung

Quelle: Liu, X. et al. Ein bakterielles orales Fütterungsverfahren mit antibiotikabehandelten Mücken. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Zerlegung des Mückenmitteldarms zur Isolierung von Darmbakterien. Der Mitteldarm wird aus dem Verdauungstrakt extrahiert, homogenisiert, um die Bakterien freizusetzen, und auf Nährstoffagar versetzt, um Bakterienkolonien zu kultivieren.

Protokoll

1. Seziere den Mückenmittelarm
   1. Übertragen Sie die oberflächensterilisierte Mücke mit einem Tropfen sterilen 1x phosphatgepufferten Kochsalzpuffers (PBS) auf den Glasträger. Sezieren Sie unter dem Seziermikroskop.
   2. Bei der niedrigeren Vergrößerung des Seziermikroskops werden die Beine, Flügel und der Kopf der Mücke vorsichtig entfernt, um eine Flucht zu verhindern. Entfernen Sie die letzte Somit der Mücke, indem Sie direkt schneiden, anstatt sie zu ziehen, um eine Zerstörung des Verdauungstrakts zu verhindern.
   3. Klemmen Sie den Thorax der Mücke und das Ende des Bauches mit einer Pinzette zusammen. Ziehe vorsichtig den Verdauungstrakt der Mücke heraus. Der erworbene Verdauungstrakt enthält üblicherweise die Frucht, den Vordarm, den Mitteldarm, den Hinterdarm und die Malpigh-Röhren.
   4. Stellen Sie das Seziermikroskop auf eine höhere Vergrößerung ein. Entfernen Sie die Frucht-, Vorderdarm-, Hinterdarm- und Malpighian-Röhrchen aus dem dissektionierten Verdauungstrakt, um den Mitteldarm der Mücke zu erhalten.
   5. Seien Sie vorsichtig beim Entfernen der Pflanze, da die Pflanze nach der Aufnahme einer Zuckermahlzeit aufbläht und dem Mitteldarm ähnelt. Die Malpighian-Röhren, eine Gruppe langer und dünner Ausscheidungsröhren, befinden sich an der Grenze zwischen Mitteldarm und Hinterdarm.
2. Isolation von Darmbakterien
   1. Übertragen Sie den dissektionierten Mitteldarm in ein steriles 1,5-ml-Rohr mit 200 μL sterilem 1x-PBS-Puffer.
   2. Mahlen Sie den Mitteldarm auf einer sterilen Bank gründlich mit einem sterilen Stößel, um eine vollständige Freisetzung der Darmbakterien in den Puffer zu ermöglichen.
   3. Serielle Verdünnung des Homogenats zu drei 10-fachen Verdünnungen. Gib 50 μL jeder Verdünnung auf die LB (Luria-Brühe) Agarplatte und verteile sie auf der Platte. Wenn der Mitteldarm eine hohe Konzentration an Darmflora aufweist, ist es wichtig, weitere serielle Verdünnungen vorzunehmen, um einzelne Kolonien herauszufiltern.
   4. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 1–2 Tage, bis einzelne Kolonien sichtbar sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aedes aegypti			Weibliche Mücken
Zentrifugenröhre	Sangon Biotech	F601620-0010	1,5 ml, natürlich, abgestuft, steril
Einweg-Tissue-Mahlmittel-Stößel	Sangon Biotech	F619072-0001	70 mm lang, konisch, blau, steril
Pinzette	Heckantrieb	F11029	Dissektion
LB-Agarpulver	Sangon Biotech	A507003	Trypton 10,0 g, Hefeextrakt 5,0 g, NaCl 10,0 g, Agar 15,0 g.
Mikroskop	Zeiss	Stemi508
10-facher PBS-Puffer	Sangon Biotech	E607016	Dieses Produkt ist eine 10-fache Lösung. Bitte verdünnen Sie es vor der Anwendung 10 Mal. Der pH-Wert liegt bei 7,4.