Etablierung einer definierten Darmbakterienpopulation bei erwachsenen Mücken

Zusammenfassung

Quelle: Liu, X. et al. Ein bakterielles orales Fütterungsverfahren mit antibiotikabehandelten Mücken. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Erschöpfung der natürlichen Darmmikrobiota bei Mücken mit einer antibiotikahaltigen Saccharoselösung. Darauf folgt eine kontrollierte Rekolonisierung mit einer bakteriellen Suspension, die über ein Membranfütterungssystem geliefert wird, um eine definierte Bakterienpopulation im Mückendarm zu etablieren.

Protokoll

1. Antibiotikatherapie und Wiedereinführung von Bakterien

1. Bereite die antibiotische Lösung vor.
   1. Wägen Sie die erforderliche Menge an Saccharose, Penicillin und Streptomycin, um eine 10%ige Saccharoselösung mit 20 Einheiten Penicillin und 20 μg Streptomycin pro ml herzustellen.
2. Füttere Mücken mit der Antibiotiklösung.
   1. Betäuben Sie die Mücken bei 4 °C für 3–5 Minuten. Füllen Sie die Mücken in einen Pappbecher. Decken Sie die Oberseite mit Mull ab und umschließen Sie die Kompresse mit Klebeband, um das Entkommen von Mücken zu verhindern.
   2. Tauchen Sie sterile Wattebäusche in die antibiotische Lösung und legen Sie sie vorsichtig auf den Mückenbecher. Drücken Sie die Wattebäusche vor der Benutzung, um zu verhindern, dass Mücken in den tropfenden Wattebäuschen ertrinken.
   3. Decken Sie die Wattebäusche mit einer 10 cm langen Petrischale ab, um eine Verdunstung von Feuchtigkeit zu verhindern. Ersetzen Sie die Wattebäusche zweimal täglich für drei aufeinanderfolgende Tage.
3. Herstellung der bakteriellen Suspension
4. Messen Sie die bakterielle Lösung mit einem Spektrophotometer. Gib 1 OD (OD₆₀₀₀) bakterielle Suspension in ein 1-mL-Rohr. Zentrifugiere die Suspension bei 5.000 x g für 5 Minuten bei 4 °C.
5. Verwerfen Sie das Überdachungsmittel und fügen Sie 1 ml sterilen 1x PBS-Puffer in ein 1,5-mL-Rohr zur Suspensionsausschlagung hinzu.
6. Zentrifugieren bei 5.000 x g für 5 Minuten bei 4 °C; Entsorge das Supernatant.
7. Wiederhole die Schritte 2.4.2 und 2.4.3.
8. Fügen Sie 200 μL sterilen 1x phosphatgepufferten Kochsalzlösungspuffer (PBS) zur bakteriellen Präzipitation hinzu.
9. Fügen Sie 600 μL 10%ige Saccharoselösung, 200 μL 10 mm Adenosin 5′-Triphosphat (ATP), das als Phagostimulans wirkt, und 200 μL bakterielle Suspension in ein steriles 1,5-mL-Rohr ein. Mischen Sie durch Vortexen.
10. Füttere die Mücke mit der Bakteriensuspension.
    1. Mücken werden 24 Stunden lang ausgehungert, sodass die Antibiotika sich verstoffwechseln können, bevor die Bakterien gefüttert werden.
    2. Bauen Sie das Membranzufuhrsystem zusammen.
    3. Versiegeln Sie die sterilisierte Zuführeinheit mit Parafilm oder alternativ einer Kollagenmembran.
    4. Setzen Sie einen Kunststoffring an und fixieren Sie ihn mit Parafilm, um Bruch durch Reibung beim Füttern zu vermeiden.
    5. Fügen Sie die vorbereitete bakterielle Lösung langsam in die Zuführeinheit ein.
       Hinweis: Nur ein Brunnen der Zwei-Brunnen-Zuleitungseinheit kann mit der Lösung gefüllt werden und bedeckt die Zuleitungseinheit nur von der Reagenzabwurfseite aus.
    6. Verbinden Sie die Zuführeinheit mit einem auf 37 °C vorgeheizten Zuführsystem, das die menschliche Temperatur simuliert, um Mücken anzulocken. Legen Sie das Fütterungsgerät auf einen mit Mücken gefüllten Pappbecher und füttern Sie 90 Minuten lang.
    7. Nach dem Fressen betäuben Sie die Mücken, indem Sie sie 3–5 Minuten bei einer Temperatur von 4 °C aussetzen und sie in einer eiskalten Petrischale betäuben.
    8. Wähle die vollständig angeschwollenen Mücken für weitere Studien.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Adenosin-5′-Triphosphatdinatrium-Salzhydrat	Sigma	A2383	Adenosin-5′-Triphosphatdinatriumsalhydrat wurde zur Herstellung von Adenosintriphosphat (ATP)-Standardlösungen verwendet.
Hämotek-Membran-Feedsystem	Hemotek		Komponenten des Zuführungssystems, darunter Hemotek-Temperaturregler, Zuführgehäuse, Metallzufuhr montiert.
Parafilm	Sangon Biotech	F104002	4 Zoll x 125 Fuß
Petrischale	Sangon Biotech	F611203
Penicillin G Procain-Salzhydrat	Sangon Biotech	A606248	Weißes Pulver. Löslich in Wasser, löslich in Methanol, leicht löslich in Wasser, Ethanol
Streptomycinsulfat	Sangon Biotech	A610494	Streptomycinsulfat ist ein Glucosamin-Antibiotikum, das die Synthese prokaryotischer Proteine stört.
Sucrose	Sangon Biotech	A502792	Löslich in Wasser, Ethanol und Methanol, leicht löslich in Glycerol und Pyridin.
10-facher PBS-Puffer	Sangon Biotech	E607016	Dieses Produkt ist eine 10-fache Lösung. Bitte verdünnen Sie es vor der Anwendung 10 Mal. Der pH-Wert liegt bei 7,4.