Live-Bildgebung des Makrophagenzelltods während einer mykobakteriellen Infektion in Zebrafisch-Embryonen

Zusammenfassung

Quelle: Niu, L., et al. Visualisierung des Makrophagen-lytischen Zelltodes während einer mykobakteriellen Infektion in Zebrafisch-Embryonen mittels intravitaler Mikroskopie. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert den Einsatz der intravitalen konfokalen Mikroskopie, um den Makrophagen-lytischen Zelltod in Zebrafischembryonen nach einer Mycobacterium marinum-Infektion zu visualisieren.

Protokoll

1. Live-Imaging der Infektion

1. 1. Fischmontage für Live-Imaging
   1. Übertragen Sie bis zu 10 tricain-anästhesierte Embryonen in die Mitte einer Glasboden-35-mm-Schale. Zusätzliche E3 Medium abwerfen.
   2. Decken Sie das Gericht mit 1 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt ab und richten Sie die Zebrafischembryonen sorgfältig mit einer 10-G-Nadel aus. Inkubiere die Glasbodenschale 10 Sekunden auf Eis, damit die Agarose fest wird.
      HINWEIS: Für die Mittelhirninjektion sollten die Embryonen im Agarose montiert werden, wobei der Kopf nach oben gerichtet ist (Abbildung 1A).
   3. Sobald sie vollständig erstarrt ist, bedecken Sie die Agarose mit einer Schicht Eiwasser (plus 1 x Tricain und PTU (N-Phenylthiourea)).
2. Drei-Farben-Hochauflösungs-Zeitraffer-Konfokalmikroskopie
   HINWEIS: Die folgenden Schritte werden an einer Konfokalmikroskopie durchgeführt, die mit einer 63,0x 1,40 Öl-UV-Objektivlinse ausgestattet ist.
   1. Stellen Sie die Temperatur der Umweltkammer auf 28,5 °C ein. Legen Sie etwas feuchtes Seidenpapier in die Kammer, um Feuchtigkeit zu erzeugen und das Verdunsten des Eiwassers zu verhindern.
   2. Stelle die 35-mm-Glasbodenschüssel zusammen mit dem Zebrafisch in die Umweltkammer.
   3. Öffnen Sie die Konfokalsoftware und initialisieren Sie die Stufe. Schalte auf das 63,0 x 1,40 Öl-UV-Objektiv um und lokalisiere den Zebrafisch über den Hellfeldkanal mit einem Differential-Interferenzkontrastfilter (DIC).
   4. Öffne die 405-Diode, Argon (20 % Strom) und DPSS 561 nm Laser. Stellen Sie die passenden Laserleistungs- und Spektrumeinstellungen ein.
      HINWEIS: Im Folgenden sind die Spektrumeinstellungen für Cerulean (Anregung = 405 nm; Emission = ~456–499 nm), eGFP (Anregung = 488 nm; Emission = ~500–550 nm), DsRed2 (Anregung = 561 nm; Emission = ~575–645 nm) aufgeführt
   5. Wählen Sie den "XYZ" "Sequential Scan"-Aufnahmemodus und stellen Sie das Bildformat auf "512 x 512 Pixel" ein.
   6. Wechsle auf "Live Data Mode". Zielen Sie auf die Position des ersten Zebrafischs und markieren Sie die Positionen "Begin" und "End" Z. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes der verbleibenden Embryonen. Am Ende des Programms kann eine "Pause" hinzugefügt werden.
   7. Definiere die Schleife und den Zyklus des Programms.
   8. Speichere die Datei.

Ergebnisse

Abbildung 1: Aufhängen von Zebrafisch-Embryonen für die lebende Bildgebung. (A) Bei einer Mittelhirninfektion wurden Zebrafisch-Embryonen mit nach unten gerichteten Köpfen montiert. (B) Bei der Infekt...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Eine 35-mm-Glasbodenschüssel	In-vitro-Wissenschaft	D35-10-0-N
Agarose	Sangon Biotech	A60015
Konfokalmikroskop	Leica	TCS SP5 II
Umweltkammer	Pecon	Temperaturregelung 37-2 digital
Mycobacterium marinum			ATCC BAA-535
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma	P7629