In-vitro-Untersuchung der bakteriellen Tötung durch neonatale Maus-Milzphagozyten

Zusammenfassung

Quelle: Seman, B. G., et.al. Neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video demonstriert die Isolierung von Neutrophilen und entzündlichen Monozyten aus neonatalen Mausmilzen und deren Anwendung in einem leuchtenden bakteriellen Tötungsassay. Es behandelt mechanische Dissoziation, rote Blutkörperchenlyse, magnetische perlenbasierte Zellanreicherung, bakterielle Inkubation und Antibiotikaschutz. Zeitgesteuerte Lumineszenzmessungen zeigen eine anfängliche bakterielle Internalisierung gefolgt von immunvermittelter Clearance.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tierproben betreffen, wurden vom zuständigen ethischen Ausschuss für Tiere überprüft und genehmigt.

1. In-vitro-bakteriellen Tötungstest

1. Entfernen Sie die Milz eines nicht infizierten neonatologischen Welpen und legen Sie sie in einen 40 μm großen Nylonkorb in einer sterilen 60-mm-Petrischale. Wiederholen Sie dies und legen Sie die Milzen zu einem Rohr zusammen, um gemeinsam geerntet und homogenisiert zu werden.
2. Fügen Sie 5 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS).
3. Zerlege das Gewebe mit einem sterilen 3-ml-Spritzenplumpen, bis eine Einzelzellsuspension entsteht.
4. Sammeln Sie die Einzelzellensuspension außerhalb des Nylon-Korbs, übertragen Sie sie in ein 15-mL Zentrifugenrohr und Pelletzellen mit 350 x g für 5 Minuten.
5. Die Zellen werden in einem roten Blutkörperchen-Lysepuffer (2 ml für bis zu 7–8 Milzen) suspendiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um Erythrozyten zu eliminieren.
6. Waschen Sie die Splenozyten wie oben mit PBS und Pellets.
7. Suspendieren Sie die Splenozyten in 0,25 mL PBS, ergänzt mit 0,5 % BSA und 2 mM EDTA entsprechend der erwarteten Zellausbeute.
8. Zählen Sie die Splenozyten mit einem Hämozytometer oder einer anderen geeigneten Anwendung.
9. Isolieren Sie Ly6B.2⁺ (myeloide Population von Granulozyten/entzündlichen Monozyten) Zellen mit immunmagnetischen Perlen.
10. Säe Ly6B.2^+- Zellen mit einer Dichte von 1 x 10^{5 Zellen pro} Bohrloch in einer schwarzen oder weißen 96-Well-Platte in einem Volumen von 0,1 mL DMEM, die 10 % FBS, 2 mM Glutamin und 25 mM HEPES (vollständiges Medium) enthält.
11. Zähle biolumineszente E. coli auf und bereite das bakterielle Inokulum bei der gewünschten Infektionsmultiplikation (MOI) in einem Endvolumen von 0,1 ml vor. Dies wird am besten erreicht, indem man das Notwendige für alle Brunnen mit einem gemeinsamen MOI in Chargen produziert.
12. Fügen Sie 0,1 ml bakterielles Inokulum oder ein vollständiges Medium allein als Kontrolle hinzu. Inkubieren Sie die Mehrfachbrunnenplatte bei 37 °C und 5 % CO2_{für 1} Stunde.
13. Ersetzen Sie das Medium durch 0,2 ml frisches Komplettmedium, das Gentamicin (100 μg/mL) enthält, indem Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette entfernen und frisches Medium mit einer neuen Pipettenspitze hinzufügen. Bringen Sie die Kultur für weitere 2 Stunden in die Brutzeit zurück.
14. Drei Stunden nach der Infektion wird die Lumineszenz in jedem Brunnen der mit Deckel versehenen Kulturplatte von unten mit einem Plattenmesser gemessen und anschließend die Kultur wieder in die Inkubation gebracht.
15. Wiederholen Sie Messungen der Lumineszenz an anderen gewünschten Zeitpunkten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ACK Lysis-Puffer	Gibco	LSA1049201	Bakterien-Clearance-Assay
Anti-Ly-6B.2-Mikroperlen	Miltenyi Biotec	130-100-781	Zellisolierung
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (drückt Luciferase aus)	N/A	N/A	Intern bei WVU gebaut
Isolationspuffer	Miltenyi Biotec	N/A	Bakterien-Clearance-Assay
LB Broth, Lennox	Fisher-BioReagenzien	BP1427-500	Bakterienwachstum
EASYstrainer (Nylonkorb)	Greiner Bio-one	542 040	Zellsieb
SpectraMax iD3	Molekulare Bauelemente	N/A	Kennzeichenleser