Modellierung von Infektionen bei neonatalen Mäusen mit gekapselten biolumineszenten Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Seman, B. G. et al. Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis. J. Vis. Exp. (2020)

Das Video demonstriert ein neonatales Mausmodell zur Untersuchung systemischer Infektionen mit gekapselten biolumineszenten Bakterien. Neugeborene Welpen werden mit hoch- oder niedrigdosierten bakteriellen Suspensionen injiziert und zur Nachsorge zu ihrer Mutter zurückgegeben. Die gekapselten Bakterien entgehen der frühen Immundetektion, breiten sich systemisch aus und werden zeitlich mittels Lumineszenzbildgebung visualisiert. Dieses Modell ermöglicht eine nicht-invasive Verfolgung des Infektionsverlaufs bei Neugeborenenmäusen.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.

1. Herstellung des bakteriellen Inokulums

1. Streaken Sie eine tryptische Soja-Agar-Platte (TSA) mit einer Inokulationsschleife zur Isolierung einer einzelnen Kolonie aus einem Gefrierbestand von Escherichia coli O1:K1:H7-lux , der stabil Luciferase ausdrückt und Kanamycin-Resistenz besitzt. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
2. Am folgenden Tag lassen Sie die Luria-Brühe (LB) in einem Biosicherheitsschrank auf Zimmertemperatur (25 °C) erreichen.
3. Unter einer Biosicherheits-Kabinetthaube wird eine einzelne Kolonie von der gestreiften Platte identifiziert und mit 3 ml LB mit Kanamycin (30 μg/mL) geimpft. Über Nacht bei 37 °C mit einem Schütteln von 220 Umdrehungen pro Minute (U/min) inkubieren. Das ist die Starterkultur.
4. Verdünne die Anlasserkultur 1:100 in frische 3 mL LB unter einer Biosicherheits-Schrankhaube und bringe sie 2-3 Stunden bei 37 °C mit Schütteln (220 U/min) in den Inkubator zurück. Das ist die Bestandskultur.
5. Lesen Sie die optische Dichte (OD) sowohl des Blanklings als auch der Bestandskultur bei 600 nm mit einem Spektrophotometer ab. 100 μL LB (ohne Bakterien) in einen Brunnen einer 96-Wellen-Flat-Bottom-Testplatte geben; Das ist die Lücke. Dann werden 100 μL aus der Lagerkultur zu einem separaten Brunnen hinzugefügt. Wiederhole das für zwei weitere Replikate. Die Absorption wird mit einem Plattenleser gemessen.
6. Subtrahieren Sie die Blank-Absorption vom Absorptionswert der Bestandskultur (dem OD-Wert) und vergleichen Sie sie mit einer zuvor generierten und validierten Wachstumskurve, um eine Annäherung der Bakteriendichte in der Bestandskultur für die Herstellung der infektiösen Dosis zu bestimmen.
7. Erstelle je nach Forschungsfrage Zielinokula. Für diese Studie wurden Zielinokulum von 2 x 10⁶ (niedrig) und 7 x 10⁶ (hoch) koloniebildenden Einheiten (CFUs) pro Maus (/Maus) verwendet.
   1. Teilen Sie die Zieldosis pro Maus (DoseT) durch die geschätzte Bakterienkonzentration in der Stockkultur (Stock), um das benötigte Bakterienvolumen aus dem Röhrchen (VS) zu erhalten.
   2. Multipliziere VS mit der Anzahl der Mäuse (NM), die infiziert werden müssen, zusammen mit genug für 5–10 zusätzliche Mäuse, für die Gesamtmenge an Bakterien, die für die Infektion benötigt werden, plus 5–10 zusätzliche Dosen. Entferne dieses Volumen aus dem Stockrohr und gib es in ein neues Zentrifugenrohr.
   3. Verwenden Sie die folgende Gleichung: DoseT/Stock = VS x NM = Gesamtvolumen (VT) der Bakterien, die aus dem Rohr entfernt werden sollen.
8. Zentrifugieren Sie die Bakterien bei 2.000 x g für 5 Minuten bei 4 °C und suspendieren Sie das bakterielle Pellet in 50 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,2–7,6) pro zu infizierender Maus (z. B. bei 10 Dosen von jeweils 2 x 10⁶ Bakterien wird das Pellet von 2 x 10⁷ Bakterien in 500 μL PBS resuspendiert). Auch hier wird empfohlen, mehr Inokulum vorzubereiten als nötig. Bereiten Sie eine gleiche Menge PBS nur für Kontrollimpfungen vor. Halten Sie das infektiöse Inokulum und PBS auf Eis aufrecht, bis zur Infektion.
9. Führen Sie sieben zehnfache serielle Verdünnungen in PBS in einer 96-Well-Kunststoffboden-Verdünnungsplatte durch und verlagern Sie 25 μL der Verdünnungen doppelt auf Quadranten-TSA-Platten, ergänzt mit Kanamycin (30 μg/mL), um die tatsächliche Menge der verabreichten Bakterien aufzuzählen. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C zur Koloniebildung vor der Zählung.

2. Tierbestimmung

1. Organisiere eine ausreichende Anzahl von Zuchtpaaren, damit die Würfe für altersgleiche Jungtiere synchronisiert werden können. Die Altersvariabilität von ± 1 Tag ist akzeptabel.
2. Identifizieren Sie eine trächtige C57BL/6 weibliche Maus und überwachen Sie die Geburt des Wurfs im Vorfeld des geplanten Experiments, um das Alter genau zu bestimmen.
3. Um zwischen Kontroll- und infizierten 3- oder 4-Tage-alten Welpen zu unterscheiden, verwenden Sie eine kleine, feinspitzige Irisschere, um nur die Enden der Schwänze der Kontrollwelpen abzuschneiden. Die infizierten Jungtiere erhalten keine Schwanzschnitte. Desinfizieren Sie die Haut vor dem Schneiden mit einem Wattebäusch, das in 70 % Ethanol getränkt ist. Üben Sie bei Bedarf Druck auf das Ende des Schwanzes mit einem Wattebausch oder Mull aus.
   HINWEIS: Dieses Verfahren wird unter einer Biosicherheits-Schrankhaube durchgeführt. Ein Schwanzschnitt von etwa 1/8 Zoll reicht aus.
4. Um Welpen in der Kontroll- und Infektionsgruppe zu identifizieren, verwenden Sie eine 1-mL Insulinspritze mit einer 28 G x 1/2'' permanenten Nadel, um die Schwänze der Welpen zu tätowieren. Desinfizieren Sie die Haut vor dem Tätowieren mit einem Wattebausch, der mit 70 % Ethanol übergossen ist. Dieses Verfahren wird unter einer Biosicherheits-Schrankhaube durchgeführt.
5. Um den Schwanz zu tätowieren, tragen Sie Tiertattoo-Tinte auf die Nadelspitze auf. Als Nächstes fesseln Sie den Welpen vorsichtig mit einer Hand, wobei der Schwanz vollständig freiliegt. Führen Sie die Nadel vorsichtig unter die Haut, wobei eine oberflächliche Tiefe erhalten bleibt, und bewegt die Nadel einige Millimeter parallel zur Haut, bis eine kleine Markierung oder ein Punkt entstanden ist. Warte ein paar Sekunden, bevor du die Nadel langsam unter der Haut herausziehst, um zu vermeiden, dass übermäßige Tinte unter der Haut freigesetzt wird.
6. Üben Sie bei Bedarf Druck mit einem Wattebausch oder Mull auf die Wunde aus. Entfernen Sie überschüssige Tattoo-Tinte auf der Hautoberfläche mit 70 % Ethanol.
7. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den folgenden Mäusen in der infizierten und Kontrollgruppe, während Sie bei jedem tätowierten Welpen einen zusätzlichen Punkt hinzufügen (z. B. hat Welpe 1 einen Punkt am Schwanz, Welpe 2 zwei Punkte am Schwanz usw.).
   HINWEIS: Für eine zusätzliche Identifizierungsschicht wird empfohlen, für die Kontroll- und infizierten Gruppen separate Farben der Tiertattoo-Tinte zu verwenden.

3. Subskapulare Impfung

HINWEIS: Für diese Studie wurden zwei Experimente durchgeführt, wobei für jedes Experiment eine Gruppe mit niedriger und hoher Dosis zugewiesen war. Im ersten Experiment erhielten 7 Welpen das niedrig dosierte Inokulum (4 Welpen wurden als Kontrollpersonen verwendet), und 5 Welpen aus einem separaten Wurf erhielten die hohe Dosis (3 Welpen wurden als Kontrollpersonen eingesetzt). Die Jungen aus Experiment 1 lieferten Daten nur für den 24-Stunden-Zeitpunkt. Im zweiten Experiment erhielten 8 Welpen das niedrig dosierte Inokulum (2 Welpen wurden als Kontrollpersonen verwendet) und 6 Welpen erhielten das hochdosierte Inokulum (2 Welpen wurden als Kontrollpersonen eingesetzt). Die Welpen aus Experiment 2 lieferten Daten für die 0-, 10- und 24-Stunden-Zeitpunkte.

1. Altersmatching-Welpen ≤ 1 Tag. Weisen Sie jeden Wurf entweder als niedrigdosierter oder hochdosierter Wurf zu. Innerhalb eines Wurfs werden die Welpen zufällig als Kontroll- oder infizierte Welpen zugeteilt.
2. Am Tag 3 oder 4 nach der Geburt werden die Gewichte aller Welpen vor der Impfung mit E. coli-lux oder der PBS-Kontrolle erfasst. Trennen Sie die Mutter während dieser Zeit von den Welpen, um sicherzustellen, dass sie während der Infektion nicht bewegt werden.
3. In einem Biosicherheitsschrank wird mit einer Insulinnadel entweder PBS oder das E. coli-lux-Inokulum aspiriert. Für diese Arbeit wurden Inokula aus 2 x 10⁶ und 7 x 10⁶ CFU pro Maus verwendet. Bewahren Sie sowohl das infektiöse Inokulum als auch das PBS bis zur Verabreichung durch subskapuläre Injektion auf Eis.
4. Leg den Neugeborenen auf eine saubere Fläche in der Kapuze des Biosicherheitsschranks und ziehe die Haut im Nacken an, als wolle du den Welpen mit Nacken anheben.
5. In den nun entstandenen Raum zwischen Haut und Muskel des Tieres wird die Nadel eingeführt, direkt unter die Haut abgeschrägt und 50 μL PBS oder E. coli-lux injiziert. Gleichzeitig wird der eingeklemmte Hautteil gelöst, um Rückfluss der Injektion zu verhindern.
6. Entfernen Sie die Nadel langsam und vorsichtig. Setzen Sie die Welpen nach den Injektionen wieder zu den Hütten. HINWEIS: Aufgrund ihres anatomischen Entwicklungsstadiums ist es technisch schwierig, neonatalen Welpen ab Tag 3 bis 4 eine Schwanzvene oder eine intraperitoneale Injektion zu verabreichen. Daher wurde für diese Studie der subskapuläre Infektionsweg gewählt, da die Durchführung erleichtert ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL Insulinspritze	Coviden	1188128012	Inokulum- oder PBS-Injektion
Tier-Tattoo-Tintenpaste	Ketchum	KI1482039	Tierbestimmung
Animal Tattoo Ink Green Paste	Ketchum	KI1471039	Tierbestimmung
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (drückt Luciferase aus)	N/A	N/A	Intern bei WVU gebaut
DPBS, 1X	Corning	21-031-CV
Difco Tryptic Soy Agar	Becton, Dickinson und Co.	236950	Bakterienwachstum
IVIS Spektrum CT und Living Image 4.5 Software	Perkin Elmer	N/A	Intravitale Bildgebung
LB Broth, Lennox	Fisher-BioReagenzien	BP1427-500	Bakterienwachstum