In-situ-Nachweis von Bakterien in Maus-Zahnfleischgewebeschnitten

Quelle: Choi, Y. S., et al. In-situ-Nachweis von Bakterien in paraffineingebetteten Geweben mit einer digoxin-markierten DNA-Sonde, die auf 16S-rRNA abzielt. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video demonstriert die In-situ-Detektion von Bakterien in Maus-Zahnfleischgewebeschnitten mit digoxin-markierten DNA-Sonden, die auf bakterielle DNA abzielen. Der Abschnitt wird mit der Sonde inkubiert. Alkalische Phosphatase-konjugierte Antikörper, die spezifisch für Digoxin sind, werden hinzugefügt. Endogene Phosphatasen werden inaktiviert, und durch Substratzugabe wird ein gefärbtes Niederschlag gewonnen. Der Abschnitt wird mit Gegenfärbung, Dehydrierung, mit Xylol gereinigt und vor der mikroskopischen Visualisierung der Bakterien montiert.

Alle Verfahren, die Tierproben betreffen, wurden vom zuständigen ethischen Ausschuss für Tiere überprüft und genehmigt.

1. Sondenvorbereitung

PCR-Amplifikation der Sonde
1. Für die Porphyromonas gingivalis-spezifische Sonde wird ein 343-bp-DNA-Fragment von P. gingivalis 16S rRNA mittels PCR unter Verwendung der genomischen DNA von P. gingivalis und folgenden Primern amplifiziert: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' und 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'. Führen Sie Verstärkungen mit folgenden Zyklusbedingungen durch: 35 Zyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 1 Minute 20 S, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72 °C.
2. Amplifizieren Sie die eubakterielle Sonde mit einem 70-bp-DNA-Fragment (5'-CAGGTGCTGCTGCATGGGTCGTCGTGTGTTGTGTGTGTTGGGTTAAGTCCCCAACGAGCGCAACCC-3'), synthetisiert als Oligonukleotid und folgenden Primern: 5'-CAG, GTR, CTG, CMT, GGY-3' und 5'-AGG, GTT, GCG, CTCC, GTT-3'. Führen Sie Verstärkungen mit folgenden Zyklusbedingungen durch: 40 Zyklen bei 94 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 1 Minute 20 Sekunden, gefolgt von einer 5-minütigen Verlängerung bei 72 °C.
3. Fällen Sie die PCR-Produkte (≥500 μl) aus, indem Sie 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 100 % Ethanol (im Verhältnis 10:1:2) hinzufügen und bei -20 °C für 2 Stunden inkubieren.
4. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 14.000 x g für 15 Minuten, suspendieren Sie das Pellet in 100 μl Tris-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder TE-Puffer und messen Sie die DNA-Konzentration anhand der optischen Dichte bei 260 nm.
Digoxigenin (DIG)-Kennzeichnung mit einem DIG-DNA-Kennzeichnungs- und Nachweiskit
1. Mische 3 μg der Sonde mit Wasser zu einem Endvolumen von 15 μl.
2. Denaturiere die DNA bei 95 °C für 10 Minuten und kühle sie schnell auf Eis.
3. Fügen Sie 2 μl 10-fache Hexanukleotidmischung, 2 μl Desoxynukleosidtriphosphat (dNTP)-Markierungsmischung und 1 μl Klenow-Enzym zu 15 μl der denaturierten DNA hinzu.
4. Mischen und bei 37 °C 24 bis 48 Stunden inkubieren und stoppen Sie die Reaktion durch Erhitzen bei 65 °C.
Überprüfen Sie die Empfindlichkeit der DIG-markierten Sonde mit einem DIG-DNA-Kennzeichnungs- und Detektionskit
1. Laden Sie manuell 1 μl serielle Verdünnungen der im Kit enthaltenen Positivkontrollproben und 1 ng der DIG-beschrifteten Sonde auf die Nylonmembran ein und trocknen Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
2. Weichen Sie die Membran kurz in einem 2x Salz-Natriumcitrat-(SSC)-Puffer (0,3 M Natriumchlorid oder NaCl, 30 mM Natriumcitrat, pH 7,0) ein und inkubieren Sie die Membran bei 80 °C für 1 Stunde, um die DNA zu immobilisieren.
3. Die Membran kurz in einen Malinsäurepuffer (MAB, 0,1 M Malinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) einweichen und mit anti-DIG-alkalischer Phosphatase (AP)-konjugierten Antikörper (1:5.000) in 6 ml Blocklösung aus dem Kit bei RT für 30 Minuten inkubieren.
4. Waschen Sie die Membran mit MABT (MAB enthält 1 % Tween 20) und tragen Sie 40 μl der nitroblauen Tetrazolium/5-Brom-4-Chlor-3'-Indolylphosphat-Lösung (NBT/BCIP) für 1 Minuten auf die Membran auf, gemischt mit einem 2-ml-Detektionspuffer (0,1 M Tris(Hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid oder Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M Magnesiumchlorid oder MgCl₂, pH 9,5) auf die Membran. Wenn die Empfindlichkeit der beschrifteten Sonde nicht zufriedenstellend ist, wiederholen Sie Schritte von 1.1.3 bis 1.3.4.
5. Messen Sie die DNA-Konzentration der markierten Sonde (OD₂₆₀) und passen Sie die Konzentration auf 100 ng μl-1 an.
Überprüfe die Spezifität der DIG-gekennzeichneten Sonde
1. Denaturieren genomische DNA-Proben (25 ng 3 μl-1 pro Probe) verschiedener Bakterienarten, einschließlich des Bakteriums, das von der spezifischen Sonde anvisiert wird, bei 95 °C für 10 Minuten und kühlen sie schnell auf Eis.
2. Lade die denaturierte DNA manuell auf die Nylonmembran und lasse sie 20 Minuten bei RT trocknen.
3. Weichen Sie die Membran kurz in einen 2x SSC-Puffer ein und inkubieren Sie die Membran bei 80 °C für 2 Stunden, um die DNA zu immobilisieren.
4. Blockieren Sie die Membran mit einer Blocklösung bei RT für eine Stunde.
5. Die Sonde bei 1 ng μl-1 im Hybridisierungspuffer verdünnen, die verdünnten Sonden denaturieren und auf die Membran auftragen.
6. Inkubieren Sie die Membran bei 45 °C für 1 Stunde.
7. Wasche die Membran dreimal mit 2x SSC-Puffer.
8. Die Membran kurz in MAB einweichen.
9. Inkubieren Sie mit anti-DIG, AP-konjugiertem Antikörper, verdünnt (1:2.000) in 6 ml Blocklösung bei RT für 1 Stunde.
10. Waschen Sie die Membran mit MABT und tragen Sie 40 μl der NBT/BCIP-Lösung mit 2 ml Detektionspuffer auf.
11. Wenn die Sonde die erwartete Spezifität nicht erreicht, wird die Hybridisierungstemperatur erhöht, bis die Spezifität beobachtet ist.

2. In-situ-Hybridisierung

Hinweis: Um das Trocknen der Proben und Reagenzien zu vermeiden, führen Sie alle Inkubationen in einer befeuchteten Kammer durch, die mit feuchten Papiertüchern ausgekleidet ist.

Entparaffinisierung und Rehydratisierung von Gewebeschnitten
1. Bereiten Sie 4 μm dicke Gewebeschnitte aus paraffinhaltigen Blöcken vor. Formalin, Paraformaldehyd und zinkbasiertes Fixativ sind mit diesem Protokoll kompatibel.
2. Bereiten Sie alle Reagenzien mit mit Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser vor.
3. Erhitze die Folien in einem Trockenofen bei 60 °C für 30 Minuten und brüte die Folien bei RT 30 Minuten aus.
4. Immerse Slides dreimal in 100 % Xylol für 5 Minuten; Verwende jedes Mal frisches Xylol.
  Hinweis: Führen Sie dieses Entwachsverfahren in einer chemischen Abzugshaube durch.
5. Tauchen Sie zweimal in 100 % Ethanol für 5 Minuten ein, wobei jedes Mal frisches Ethanol verwendet wird, und rehydriert die Proben jeweils in seriellen 90 %, 80 % und 70 % Ethanol für jeweils 5 Minuten.
6. Tauchen Sie die Objektträger 1 Minute in DEPC-behandeltes Wasser und Waschen Sie die Objektträger in DEPC-behandeltem phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösungsmittel oder PBS (pH 7,4) für 6 Minuten.
Vorbehandlungen von Gewebeschnitten
1. Versenke die Objektträger 20 Minuten in 0,1 N Salzsäure und Wasch-Objektträger in DEPC-behandeltem Wasser 30 Sekunden.
2. Zeichnen Sie mit einem Wachsstift eine hydrophobe Barriere um die Proben.
  Hinweis: Die Größe der hydrophoben Barriere hängt von der Größe der Proben ab. Daher variieren die in den folgenden Schritten verwendeten Reagenzien je nach Größe der Proben, müssen jedoch die hydrophobe Barriere füllen (50 μl für kleine Proben und 400 μl für große Proben).
3. Proben werden mit 50 bis 400 μl Proteinase K (1 bis 10 μg ^ml-1 in DEPC-behandeltem PBS) in einem Trockenofen bei 37 °C für 30 Minuten behandelt und die Objektträger in DEPC-behandeltem 1x PBS für 1 Minute gewaschen.
4. Tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten in 4% Paraformaldehyd in DEPC-behandeltem PBS ein, dann Waschen Sie die Objektträger 1 Minute in DEPC-behandeltem PBS.
5. Weichen Sie die Objektträger 20 Minuten lang in 0,1 m Triethanolamin-HCl (pH 8,0) mit 0,5 % Essigsäureanhydrid und Waschen Sie die Objektträger 30 Sekunden lang in DEPC-behandeltem Wasser.
Hybridisierung mit der Sonde und Waschen
1. Immerse-Folien in 2x SSC-Puffer für 20 Minuten.
2. Verdünnen Sie die Sonde mit 1 ng ^μl-1 im Hybridisierungspuffer (4x SSC, 50 % [Vol/Vol] Formamid, 1x Denhardt-Lösung, 10% [Wt/Vol] Dextransulfat, 0,1% [Wt/Vol] Natriumdodecylsulfat, 0,4 mg ml-1 Lachsspermien-DNA). Für negative Kontrollen mischen Sie die beschriftete Sonde mit einer zehnfach überschüssigen Menge der nicht markierten Sonde.
3. Denaturieren Sie die verdünnten Sonden und übertragen Sie 50 bis 400 μl auf Gewebeschnitte. Legen Sie einen Deckel auf den Folie und versiegeln Sie ihn mit Nagellack.
4. Die Objektträger werden in der PCR-Maschine bei 90 °C für 10 Minuten erhitzt und die Objektträger über Nacht (O/N) bei 45 °C oder einer optimalen Temperatur im Schritt 1.4.11 in einer befeuchteten Kammer inkubiert.
5. Kühlen Sie die Objektträger bei 4 °C für 30 Minuten, entfernen Sie Deckungsschlitze und tauchen Sie die Objektträger wie folgt in einen seriellen SSC-Puffer: 4x SSC für 10 Minuten, vorgewärmt (45 °C), 2x SSC für 20 Minuten, 2x SSC für 10 Minuten und 0,2x SSC für 10 Minuten.
Detektion mit anti-DIG, AP-konjugiertem Antikörper
1. Wasche die Slides in MABT für 5 Minuten.
2. Blocke mit 50 bis 400 μl Blocklösung mit 1 % Tween 20 für 20 Minuten.
3. Fügen Sie 50 bis 400 μl Anti-DIG-AP-Antikörper hinzu, verdünnt in Blocklösung (1:1.000), und inkubieren Sie bei 37 °C für 90 Minuten.
4. Folien 10 Minuten in MABT waschen.
5. Immerse-Folien im Detektionspuffer mit 1 % Tween 20 für 5 Minuten.
6. Behandle mit 50 bis 400 μl 1 mM Levamisol (im Nachweispuffer mit 1 % Tween 20) für 5 Minuten, um endogene alkalische Phosphatase zu inaktivieren.
7. Verteilt 50 bis 400 μl der vorgemischten NBT/BCIP-Lösung (verdünnt im Detektionspuffer bei 1:100) auf jede Probe und inkubiert die Objektträger in einer befeuchteten Kammer bei RT für 2 bis 3 Stunden, bis das entwickelte Signal zufriedenstellend ist.
8. Spülen Sie die Objektträger mit entionisiertem Wasser, um die Visualisierung zu verhindern, und tragen Sie 50 bis 400 μl 0,05% [Gewicht/Vol] Methylgrün als Gegenfarbe bei 37 °C für 10 Minuten auf.
9. Spülen Sie die Objektträger mit deionisiertem Wasser, dehydrieren Sie sie in 100 % Ethanol und tauchen Sie sie in Xylol ein.
10. Tragen Sie 80 μl Befestigungslösung auf jede Schlitze auf und decken Sie sie mit Abdeckungen ab.

Name	Unternehmen	Katalognummer
Essigsäureanhydrid	Sigma	6404
50% Dextran-Sulfatlösung	Millipore	S4030
50X Denhardts Lösung	Sigma	D2532
Diethylpyrocarbonat (DEPC)	Sigma	P159220
Digoxigenin (DIG) DNA-Kennzeichnungs- und Nachweiskit	Roche	11 093 657 910
Formamid	Sigma	F9037
ImmEdge™ Pen	Dako	H-400
Levamisole	Vektor	SP-5000
Magnesiumchlorid	Sigma	246964
Malinsäure	Sigma	M0375
Methylgrün	Sigma	M6776
Paraformaldehyd	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Lachsspermien-DNA-Lösung	Invitrogen	#15632-011
Natriumchlorid	Sigma	S9625
Natriumcitrat	Duksan	D1420
Natriumdodecylsulfat	Amresco	227
Triethanolamin-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Forschungsorganische Organismen	3098T

In-situ-Nachweis von Bakterien in Maus-Zahnfleischgewebeschnitten

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Protokoll

Materialien

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