Visualisierung der Harnwegsinfektion in einem Mausmodell mittels Biolumineszenz

Zusammenfassung

Quelle: Luyts, N., et al. Longitudinale Nachbeobachtung von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenzbildgebung. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video demonstriert die Induktion und Verfolgung einer Harnwegsinfektion in einem Mausmodell unter Verwendung biolumineszenter E. coli, die in die Blase injiziert wird, wo bakterielle Adhäsion, Invasion und intrazelluläre Replikation stattfinden. Das vom biolumineszente Operon ausgesendetes Licht dient als Echtzeit-Marker für die Bakterienbelastung während des Infektionsverlaufs.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.

1. Impfung der Tiere

1. Vorbereitung der Tiere
   1. Wählen Sie den gewünschten Mausstamm je nach Forschungsfrage und Verfügbarkeit von Knock-out-Linien, experimentellen Details und Unterschieden in der UTI-Anfälligkeit. Beachte, dass die transurethrale Katheterisation bei weiblichen Mäusen einfacher ist. Verwenden Sie keine Tiere jünger als 8 Wochen, da sie immunologisch unreif sind. Hier wurden 12 Wochen alte weibliche C57Bl/6J-Mäuse verwendet.
   2. Bestellen Sie Tiere rechtzeitig und lassen Sie sie sich angewöhnen, idealerweise 7 Tage. Gruppentiere in individuell belüfteten Käfigen unter standardmäßigen 12-Stunden-Licht/Dunkelheitsbedingungen.
   3. Rasieren Sie den Bauchbereich der Tiere, um den Signalverlust zu begrenzen. Verwenden Sie keine Haarentfernungscreme, da diese die Haut der Tiere schnell verbrennen kann. Halten Sie das Tier fest, indem Sie Nacken und Hintergliedmaßen mit der nicht-dominanten Hand festhalten, während Sie sich mit der dominanten Hand rasieren. Alternativ kannst du dich unter Isofluran-Narkose rasieren.
      HINWEIS: Die Tiere wurden zwei Tage vor der Bildgebung rasiert, da die Tiere die rasierte Stelle noch weiter pflegen.
   4. Stellen Sie während des gesamten Experiments Wasser und Standardnahrung ad libitum bereit. Allerdings sollte man den Tieren zwei Stunden vor der Instillation Wasser entziehen, um das Blasenvolumen während der Instillation zu minimieren.
   5. Einen sterilen 24-G-Angiokatheter Spitze auf eine 100-μL-Spritze montieren und die Spritze mit der bakteriellen Lösung füllen.
      HINWEIS: Um die Hintergrundlumineszenz zu bestimmen, erhalten Sie vor der Instillation ein Basisbild (siehe Schritt 2 unten).
2. Instillation der Tiere
   1. Setzen Sie die Tiere in eine Induktionskammer und betäuben Sie sie, indem Isofluran mit reinem Sauerstoff als Trägergas eingeatmet wird (Induktion bei 3 % und Erhaltung bei 1,5 %).
   2. Setzen Sie ein Tier auf eine Arbeitsfläche in der Rückenposition und halten Sie während der Instillation eine stabile Isofluran-Anästhesie mit einem Nasenkegel aufrecht. Trage die Augensalbe auf.
   3. Entfernen Sie den Resturin durch sanfte Kompression und kreisende Bewegungen im suprapubischen Bereich. Reinigen Sie den Unterbauch vor der Instillation mit 70 % Ethanol.
   4. Schmieren Sie die Katheterspitze mit normaler Kochsalzlösung. Legen Sie den Zeigefinger der nicht-dominanten Hand auf den Bauch und drücken Sie ihn sanft nach oben. Beginnen Sie mit der Katheterisierung der Harnröhre in einem 90°-Winkel (vertikal) und neigen Sie sie, sobald Widerstand besteht, sie horizontal neigen, bevor Sie sie weiter einführen (0,5 cm).
      HINWEIS: Drücken Sie den Katheter niemals mit Kraft, da dies die Harnröhre schädigt. Sanfte Drehbewegungen können beim Einführen von Katheter hilfreich sein. Andererseits deutet ein fehlender Widerstand meist auf einen fehlerhaften Einstich in die Vagina hin.
   5. Führen Sie eine langsame (5 μL/s) Instillation von 50 μL des bakteriellen Inokulums durch (2 x 10^{7 CFU} ).
      HINWEIS: Höhere Mengen oder schnellere Instillation können Reflux in den Nieren verursachen. Während der Praxis der Technik kann blaue Tinte verwendet werden, um den Reflux zu bewerten.
   6. Nach der Instillation lassen Sie Spritze und Katheter noch einige Sekunden an Ort und Stelle und ziehen Sie dann langsam zurück, um ein Auslaufen zu verhindern. Notieren Sie alle Unregelmäßigkeiten wie hohe Undichtigkeiten oder blutigen Meatus und schließen Sie Tiere gegebenenfalls aus.
   7. Positionieren Sie das Tier in der Rückenposition am Nasenkegel der Bildungskammer und wiederholen Sie die vorherigen Schritte 1.1.1-1.1.6 für alle übrigen Tiere. Verwenden Sie pro Versuchsgruppe einen Katheter. Stellen Sie sicher, dass die Anästhesie fortgesetzt wird, und minimieren Sie die Zeit zwischen dem ersten und dem letzten Tier.
   8. Falls nötig, verabreichen Sie vor oder nach der Bildgebung Antibiotika oder experimentelle Medikamente (Schritt 2). Zum Beispiel sollte zur Verabreichung von Enrofloxacin 40 μL der Enrofloxacinlösung (100 mg/mL) zu 3,96 ml physiologischer Kochsalzlösung hinzugefügt werden, um eine Verdünnung von 1/100 zu erreichen. Injizieren Sie 100 μL/10 g subkutan um 9 Uhr morgens und 17 Uhr, um 10 mg/kg Enrofloxacin zweimal täglich für 3 Tage zu verabreichen.

2. Biolumineszenzbildgebung

1. Vorbereitung und Auswahl von Bildparametern
   1. Öffnen Sie die BLI-Erfassungssoftware (siehe Materialtabelle) und klicken Sie auf Initialisieren im Bildgebungsgerät (siehe Materialtabelle), um die Kamera und das Stage-Controller-System zu testen und die CCD-Kamera auf -90 °C zu kühlen.
      HINWEIS: Während dieses Vorgangs wird die Tür verriegelt, und der Fortschritt der Initialisierung kann auf dem Bedienfeld verfolgt werden. Ein grünes Licht zeigt an, dass die Temperatur von -90 °C erreicht wurde. Eine Warnung erscheint, wenn vor Abschluss der Initialisierung eine Bildgebung durchgeführt wird.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Daten automatisch gespeichert werden: Klicken Sie auf Acquisition Autosave und wählen Sie den richtigen Ordner aus.
   3. Wähle Lumineszenz und Foto. Überprüfe die Standard-Lumineszenzeinstellungen: Stelle den Anregungsfilter auf Block und den Emissionsfilter auf Open.
   4. Stellen Sie die Belichtungszeit beim ersten Bild auf Auto, insbesondere wenn Sie ein schwaches Signal erwarten, um eine ausreichende Anzahl von Photonen sicherzustellen. Für In-vivo-Messungen und helle Signale setzen Sie die Belichtungszeit auf ~30 s. Wenn das Bild gesättigt ist, erscheint eine Warnung. Wenn das passiert, verkürze die Belichtungszeit.
   5. Wählen Sie das Medium Binning, F/Stop 1 und wählen Sie das richtige Sichtfeld (FOV) (D für 5 Tiere).
   6. Stellen Sie die Probandenhöhe beim Fotografieren von Mäusen auf 1 cm ein.
   7. Klicken Sie dreimal auf Add im Acquisition Control Panel, um eine Sequenz von drei Bildern als technische Replikationen zu erhalten.
2. Bildgebung
   1. Setzen Sie die Mäuse in die Bildgebende Kammer in der Rückenposition und verwenden Sie den Verteiler-Nasenkegel, um während des gesamten Experiments die Anästhesie (Isofluran: 1,5 %) aufrechtzuerhalten. Bilde bis zu 5 Mäuse gleichzeitig ab und trenne die Tiere mithilfe der Lichtschutz, um Reflexionen zu verhindern.
   2. Schließen Sie die Tür und klicken Sie auf Erfassen, um die Bildbearbeitungssequenz zu starten.
   3. Fülle detaillierte Informationen zum Experiment aus (Wildtyp- und Knockout-Tiere, Behandlungen, Tag der Bildgebung usw.). Die Bildeinstellungen, wie die Belichtungszeit, werden automatisch gespeichert.
   4. Entfernen Sie die Mäuse aus der Bildaufnahmekammer und bringen Sie sie zurück in ihren Käfig. Überprüfen Sie die vollständige Genesung nach der Anästhesie. Innerhalb von Minuten sollten die Tiere vollständig wach und erkundlich sein. Bieten Sie keine Analgesie an, da dies den Verlauf der Harnwegsinfektion beeinträchtigen könnte.
   5. Bringen Sie die Käfige zurück in die belüfteten Racks bis zum nächsten Bildgebungszyklus. Nach Abschluss des Experiments wird die Tiere durch CO-2-Erstickung oder zervikale Verrenkung eingeschläfert. Tun Sie dies vor der Genesung der Isofluran-Anästhesie, um Beschwerden zu minimieren

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anästhesie-Verdampfer	Harvard-Apparat begrenzt	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	N/A	Enrofloxacin
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Gelber Angiokatheter, verwenden Sie sterile Kunststoffspitze zur Instillation
C57Bl/6J-Mäuse	Janvier	N/A
Zentrifuge 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Unchained Labs	Trinean	um eine OD von 600 nm zu messen
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Ethanol 70 % denaturiertes 5L	VWR international	85825360
Falcon 14ml Rundboden Polystyrolröhre, Schnappskappe	Corning	352057
Falcon 50ml Cellstart	Greiner	227285
Hamilton GASDICHTE Spritze, PTFE-Schlurverriegelung, 100 μL	Sigma-Aldrich	26203	um eine langsame bakterielle Instillation von 50 μL zu gewährleisten.
Inokulationsschleife	Roth	6174.1	Halter: Kunst. Nr. 6189.1
Iso-Vet 1000 mg/g	Dechra Veterinärprodukte	N/A	Isoflurane
IVIS-Spektrum In vivo Bildgebungssystem	PerkinElmer	REF 124262	Bildgebungsgerät